斑点叉尾鮰巨噬细胞移动抑制因子（MIF）基因多态性及表达分析

高磊杜小溪李乐高祥刚鲍相渤赫崇波

（1. 辽宁省海洋水产科学研究院 辽宁省海洋水产分子生物学重点实验室，大连 116023；2. 辽宁师范大学生命科学学院，大连 116029）

斑点叉尾鮰巨噬细胞移动抑制因子（MIF）基因多态性及表达分析

高磊1杜小溪2李乐2高祥刚1鲍相渤1赫崇波1

（1. 辽宁省海洋水产科学研究院 辽宁省海洋水产分子生物学重点实验室，大连 116023；2. 辽宁师范大学生命科学学院，大连 116029）

巨噬细胞移动抑制因子（MIF）是一类主要由T细胞产生、负责机体在环境协迫和炎症反应中进行免疫应答的细胞因子。根据斑点叉尾鮰MIF基因EST序列，应用RACE技术克隆了MIF 3' UTR和5' UTR序列，利用Genome Walking技术克隆了MIF启动子序列，通过特异PCR克隆MIF内含子序列，并对多个体MIF基因组序列进行多态性分析，利用荧光定量PCR研究MIF的组织分布。结果显示，斑点叉尾鮰MIF基因组序列共3 918 bp，其中编码区348 bp，编码115个氨基酸，5'UTR为70 bp，3'UTR为434 bp，启动子为1 382 bp，共有2个内含子，分别为243 bp和1 441 bp。MIF基因组序列中包含4个重复单元序列和60个多态性位点，其中共有6个SNP位于转录因子结合位点上。斑点叉尾鮰MIF mRNA在肠中表达量最高，肌肉中表达量最低。

斑点叉尾鮰 巨噬细胞移动抑制因子（MIF） 基因组序列 多态性 组织表达

巨噬细胞移动抑制因子（MIF）是在1966年被发现的一类高度保守的细胞因子［1，2］。MIF主要由T细胞产生，负责机体在环境协迫和炎症反应中进行免疫应答反应［3，4］。最近MIF被证实在免疫刺激、组织损伤以及细胞应激等过程中具有特异目的细胞的多效性，同时在内皮细胞、脑垂体细胞和特殊上皮细胞等非免疫细胞中分泌［5，6］。MIF不仅在急性和慢性炎症、自身免疫性疾病、细胞增殖和肿瘤血

管形成过程中具有重要的调节作用，同时在生命周期调节、胚胎形成和发育以及神经发育等过程中发挥重要功能［6-9］。

目前，关于MIF基因的研究主要集中在基因克隆和多态性分析中。除人、鼠和斑马鱼等主要模式生物外，MIF已在多种鱼类中有序列报道，如大黄鱼、鲈鱼、绿河鲀和红鳍东方鲀等［10-16］。MIF的基因多态性以及启动子多态与疾病抗性的关联在人类中已有较多报道。王春平等［17］发现MIF基因启动子区-794 CATT微卫星多态性与广东汉族人群子宫内膜异位症的遗传易感性相关，CATT（5/5）基因型及CATT（5）等位基因型为其易感基因型。李艳林等［18］认为MIF -794 CATT重复序列数为7/7和7/8可能与结核易感性相关。然而，MIF的基因多态性在鱼类中还鲜有报道。

斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus），亦称沟鲶，属于鲶形目，鮰科，是美国主要的淡水养殖种类之一，1984年引入我国进行驯化，于1989年繁育成功，目前已在我国30个省（区、市）开展了规模养殖，出口总量也不断增大［19］。本研究利用已报道的斑点叉尾鮰外显子序列，对启动子、内含子和3'、5'UTR序列进行克隆、测序，并通过多个体序列对多态性进行分析，利用荧光定量PCR研究MIF的组织分布，旨在为进一步研究启动子多态性与疾病的关联提供线索。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用斑点叉尾鮰采自湖北省嘉鱼某养殖场，暂养1周后选取30尾活体解剖，将肠、头肾、脾、肌、肝、鳃和脑组织用RNA Locker固定后带回实验室于-80℃保存。使用RNAprep pure Tissue Kit（北京天根）提取总RNA，利用核酸分析仪检测RNA浓度与质量。取30尾斑点叉尾鮰肌肉组织50-100 mg，按照常规酚-氯仿方法抽提基因组DNA。

1.2 方法

1.2.1 斑点叉尾鮰MIF基因克隆 根据斑点叉尾鮰MIF基因已知的外显子序列（GenBank登录号：DQ639947），利用Primer Premier 5软件设计引物3-OF、3-IF和5F（表1），利用3'-Full RACE Core Set（TaKaRa）和BD SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech）进行3'和5'UTR的扩增。设计巢式PCR引物GWR1、GWR2和GWR3，以基因组DNA为模板，按Genome Walking Kit（TaKaRa）说明步骤进行PCR扩增。为了获取斑点叉尾鮰的内含子序列，参考近缘物种MIF外显子和内含子的结构特征，研究设计了2对引物，PCR反应条件：94℃5 min；94℃ 30 s，退火30 s，72℃ 1 min，共35个循环；72℃保温10 min。所得PCR 产物经纯化后连接到pMD19-T 载体上（TaKaRa），转化感受态DH5α，PCR 检测阳性克隆后由TaKaRa公司进行双向测序。

表1 PCR扩增引物序列

1.2.2 斑点叉尾鮰MIF基因多态性分析 根据获得的MIF基因组序列设计特异性引物PolymF和PolymR（表1），以30尾斑点叉尾鮰基因组DNA为模板，扩增包括完整启动子、外显子和内含子的DNA片段，对MIF基因进行多态性分析。PCR体系为25 μL，包括2.5 μL 10×PCR buffer，2.0 μL dNTP（2.5 mmol/L），正反引物（10 μmol/L）各1.0 μL，模板1 μL，0.4 μL Pfu DNA polymerase（2.5 U/μL，北京天根）和17.1 μL灭菌水。PCR反应条件：94℃ 5

min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共35个循环；72℃10 min。PCR产物送TaKaRa公司直接进行双向测序。

1.2.3 MIF组织特异性表达 利用荧光定量PCR技术分析30尾1龄斑点叉尾鮰中MIF在肠、头肾、脾、肌、肝、鳃和脑7种组织中的分布。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit（TaKaRa）合成cDNA，以此为模板使用SYBR®Premix DimerEraserTM（TaKaRa）进行Realtime PCR。PCR体系为20 μL，其中包括2×SYBR®Premix DimerEraser 10 μL，ROX II 0.4 μL，引物（表1）各0.6 μL，模板2 μL和灭菌水6.4 μL。反应程序为：第1步95℃ 30 s；第2步95℃ 5 s，59℃20 s，72℃ 20 s，共40个循环；反应结束后进行溶解曲线分析。对于任意一个样品，目标基因（MIF）和内参基因（18S rRNA，GenBank ID：AF021880）扩增时加入等量模板，计算△CT值后进行2-△△CT计算［20］。

1.2.4 统计分析 利用MEGA5.1和BioEdit7.0软件进行多态性位点的统计确认。通过TFSEARCH程 序（http：//www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH. html）进行转录因子结合位点的预测。利用RepeatMasker程序（http：//www.repeatmasker.org/cgibin/WEBRepeatMasker）进行重复序列的统计和分析。

采用SPSS 13.0 软件对数据进行统计分析，统计数据以平均数±标准差表示。组间差异采用单因素方差（one way ANOVA）分析，两组比较采用Student t-test 进行分析，P＜0.05 代表差异显著。

2 结果

2.1 斑点叉尾鮰MIF基因组序列特征

根据斑点叉尾鮰MIF基因外显子序列设计特异性引物获得其基因组序列，共包含3 918 bp，其中编码区为348 bp，编码115个氨基酸，5'UTR为70 bp，3'UTR为434 bp（图1）。MIF基因组序列共有2个内含子，分别为243 bp和1 441 bp，所有外显子-内含子边界符合GT-AG规则（图2）。试验扩增出启动子为1 382 bp，经过序列分析发现一个CAAT-box。

图2 斑点叉尾鮰MIF基因组结构示意图

序列分析发现斑点叉尾鮰MIF基因组序列中包含4个重复单元序列，其中一个位于启动子，3个位于内含子，具体情况见表2。

表2 斑点叉尾鮰MIF基因组序列重复单元

2.2 斑点叉尾鮰MIF基因组多态性分析

斑点叉尾鮰MIF基因组序列共包含60个多态性位点，其中29个位于启动子，1个位于5' UTR，7个位于3' UTR，1个位于外显子，22个位于内含子。60个SNP中转换占55%，包括A/G 14个，T/C 19个；颠换占45%，包括A/T 9个，A/C 6个，T/G 4个，C/G 8个（表3）。其中外显子上为G-C同义突变（Val-Val）。

2.3 转录因子结合位点多态性分析

试验发现共6个SNP位于转录因子结合位点上（score＞90），具体情况见图3。在-761和-758位点，于A-A单体型中发现Pbx-1和SRY两个转录因子结合位点，在T-A单体型中发现SRY转录因子结合位点，在A-T单体型中发现CdxA转录因子结合位点。在-723位点，于T等位基因上发现HSF2转录因子结合位点。在-278位点，于T等位基因上发现CdxA转录因子结合位点。在-249和-246位点，于A-T单体型中发现CdxA转录因子结合位点。

图1 斑点叉尾鮰MIF基因组序列

表3 斑点叉尾鮰MIF基因组序列多态性

2.4 斑点叉尾鮰MIF基因在不同组织中的表达分析利用实时荧光定量PCR检测MIF mRNA在健康

斑点叉尾鮰肠、头肾、脾、肌、肝、鳃和脑7种正常组织中的表达情况，结果显示MIF mRNA在7种组织中均可见不同丰度的表达。以相应组织中18S rRNA基因标准化后的表达量为内参，比较发现，MIF基因在肠中表达量最高，肌肉中表达量最低，脾、鳃的表达量明显高于头肾、肝和脑（图4）。

图3 不同等位基因和单体型所形成的转录因子结合位点

图4 斑点叉尾鮰MIF组织表达Realtime PCR分析

3 讨论

MIF是一类在脊椎动物中广泛研究的用于调节适应性免疫反应的先天性免疫催化剂类细胞因子［4］。目前已在大黄鱼、鲈鱼、栉孔扇贝和中华绒螯蟹等水产经济动物中实现了基因克隆，并对其在病菌感染的免疫反应中所起的作用进行了研究［13，14，21，22］。然而，MIF在斑点叉尾鮰中却少有研究。本研究采用RACE、Genome Walking等方法获得了斑点叉尾鮰MIF基因组序列，共3 918 bp；通过对MIF多态性分析发现60个多态性位点；利用荧光定量PCR检测发现MIF mRNA在肠中表达量最高，肌肉中表达量最低。

本研究利用特异PCR方法获得的斑点叉尾鮰MIF基因组序列共包含3个外显子与2个内含子，内含子的两侧都具有正确的RNA剪接识别位点（GT/AG），符合外显子和内含子连接区域的GT-AG剪切原则。斑点叉尾鮰MIF基因结构与其它已报道的硬骨鱼基本相同，但其内含子序列及长度变化较大。MIF内含子2的序列长度为1 441 bp，明显长于大黄鱼的112 bp和绿河鲀的84 bp［13，15］。斑点叉尾鮰的内含子序列长度变化较大是因为内含子承担的进化压力小，故序列相似度较低，虽然在某些特定情况下能够反应不同物种间的亲缘关系，但内含子的长度和数量是可变的，同源性明显低于外显子。研究还发现斑点叉尾鮰MIF缺少信号肽和N-或O-糖基化位点，这个发现与其它物种MIF序列相似，说明鱼类与哺乳动物相似，MIF分子在表达后先在细胞内部进行储存，再通过非常规蛋白分泌途径由细胞进行释放［23］。

在人类和其它高等动物中，MIF基因组多态性的研究已十分广泛。本研究通过PCR产物直接测序的方法对斑点叉尾鮰基因组序列多态性进行了分析，在发现的60个多态性位点中共有6个SNP位于转录因子结合位点上，不仅证明了MIF基因的多态性水平较高，同时预示着序列多态性对基因表达起到重要的调节作用，这与前人的研究结果基本一致。目前已发现的人类MIF基因4个主要多态性位点依次是：-173 nt（G/C），+254 nt（T/C），+656 nt（C/G）和-794 nt（CATT重复）［24］。Donn［25］于2001年首次报道了MIF-173位点多态性与青少年先天性关节

炎的关系，Barton等也证实MIF-173位点为关节炎易感性的相关位点［26］。此外研究显示，MIF启动子-794位点CATT重复序列的拷贝数量与启动子活性有显著的相关性，启动子活性随CATT重复序列拷贝数量的增加而增强，MIF mRNA的表达水平也相应提高［24］。

在哺乳动物中，MIF在肺、皮肤、胃肠道和内分泌系统中广泛表达，表达水平受LPS、TNF和IFN等病原物质诱导出现显著变化［27］。本研究发现，在健康斑点叉尾鮰中，MIF在肠中表达量最高，肌肉中表达量最低，此外脾、鳃组织的表达量明显高于头肾、肝和脑。MIF基因的普遍性表达方式与已报道的其它脊椎动物MIF表达方式一致［15，27，28］。通常认为MIF会以既定的模式持续的以较低水平分泌，并在诱导后通过非典型分泌途径以较高水平释放［29］。斑点叉尾鮰MIF基因在不同组织中的表达方式与已知硬骨鱼有所不同。大黄鱼MIF基因在脑中表达量最高［13］，鲈鱼MIF基因在胸腺、外周血白细胞和头肾中表达量较高［14］，绿河鲀MIF基因在鳃和性腺中表达量较高［15］，条石鲷MIF基因在肝中表达量最高［30］。不同硬骨鱼MIF基因在不同组织中没有统一的表达模式，这可能与机体的生理水平和免疫状况有关，对此现象还需要进一步深入的研究。

4 结论

根据斑点叉尾鮰MIF基因EST序列，应用RACE技术克隆了MIF 3' UTR和5' UTR序列，利用Genome Walking技术克隆了MIF启动子序列，通过特异PCR克隆MIF内含子序列，并对多个体MIF基因组序列进行多态性分析，利用荧光定量PCR研究MIF的组织分布。 结果显示，斑点叉尾鮰MIF基因组序列共3 918 bp，其中编码区348 bp，编码115个氨基酸，5' UTR为70 bp，3' UTR为434 bp，启动子为1 382 bp，共有2个内含子，分别为243 bp和1 441 bp。MIF基因组序列中包含4个重复单元序列和60个多态性位点，其中共有6个SNP位于转录因子结合位点上。斑点叉尾鮰MIF mRNA在肠中表达量最高，肌肉中表达量最低。

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（责任编辑 李楠）

Polymorphisms and Expression of Macrophage Migration Inhibitory Factor Gene from Channel Catfish，Ictalurus punctatus

Gao Lei1Du Xiaoxi2Li Le2Gao Xianggang1Bao Xiangbo1He Chongbo1
（1. Key Laboratory of Marine Fishery Molecular Biology of Liaoning Province，Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute，Dalian 116023；2. College of Life Sciences，Liaoning Normal University，Dalian 116029）

Macrophage migration inhibitory factor（MIF）was considered as a unique cytokine produced by T-cell and involved in immune response to inflammation and stress. In this study, the genomic sequence of MIF was identified, and the polymorphisms and expression level were studied in channel catfish Ictalurus punctatus. The genomic sequence of MIF was identified to be 3 918 bp, consisting of a 70 bp 5'-untranslated region（UTR）, a 160 bp 3'-UTR, a 348 bp open reading frame（ORF）, two introns as 243 and 1 441 bp, and a 1382 bp promoter. Four repetitive sequences were found in promoter and introns. Sixty sites of single nucleotide polymorphisms（SNPs）were identified in MIF genomic sequence, among which 6 sites were found to locate in the binding sites for transcription factor. MIF was found to be most abundantly expressed in intestine, and weaker in other tissues. These results could give more information and greater understanding of the degree of MIF genetic variation.

Channel catfish Ictalurus punctatus macrophage migration inhibitory factor Genomic sequence Promoter polymorphism Tissue expression

2014-03-21

国家自然科学基金资助项目（30972246）

高磊，男，博士，助理研究员，研究方向：水产动物分子遗传学；E-mail：seamas_gao@163.com

赫崇波，博士，研究员，研究方向：海洋动物分子遗传学；E-mail：chongbohe@163.com