高效氯氰菊酯对斑马鱼胚胎毒性的研究

王健 刘丽丽 余凯敏 李国超 吴巍 闫艳春

（中国农业科学院研究生院，北京 100081）

高效氯氰菊酯对斑马鱼胚胎毒性的研究

王健 刘丽丽 余凯敏 李国超 吴巍 闫艳春

（中国农业科学院研究生院，北京 100081）

高效氯氰菊酯是一种Ⅱ型拟除虫菊酯类农药，对鱼类及其它水生生物具有高毒，且在其它食物中也可检测到它的残留，高效氯氰菊酯的残留对人类的健康同样具有不容忽视的影响。为了解高效氯氰菊酯对鱼、对人类的毒性机制，选用0.05、0.1、0.2、0.6、1 mg/L 五个梯度浓度的高效氯氰菊酯溶液，对斑马鱼胚胎进行毒性处理，在显微镜下观察其对斑马鱼发育形态变化和孵化率等影响。发现高效氯氰菊酯农药对斑马鱼胚胎有严重的致畸效应，这种致畸性呈现剂量依赖性。使用0.1 mol/L浓度的高效氯氰菊酯农药对斑马鱼胚胎进行处理，进行早期胚胎发育的毒性研究。采用荧光差异双向凝胶电泳（2-D DIGE）-质谱相结合的方法，鉴定出11个差异表达蛋白质。这些蛋白质与细胞骨架、应激反应和新陈代谢有关。这些研究结果为进一步研究高效氯氰菊酯对动物的毒性机制提供了基本信息。

斑马鱼 胚胎 β-高效氯氰菊酯 DIGE 质谱

斑马鱼属于辐鳍亚纲（Actinopterygii）鲤科（Cyprinidae）短担尼鱼属（Danio）［1］，是一种小型热带淡水鱼，属于硬骨鱼，成鱼体长4-5 cm，3个月可达性成熟。性成熟雌鱼每周可产卵一次，每次产卵量大约50-200枚，这为试验研究提供了丰富的材料，同时可以极大地节省试验成本和时间。斑马鱼基因与人类基因的相似度达到87%，其发育过程、器官构造、生理功能、基因结构等都与哺乳类动物非常相近。因具有遗传背景清楚、繁殖周期短、体外受精、产卵量大且过程可人为控制、胚胎透明便于观察等优点，斑马鱼常被应用于胚胎学、发育生物学、分子生物学等研究，尤其在药物研发、人类疾病研究［2-5］及毒理学［5，6］等方面。斑马鱼是理想的分子生物学和免疫学研究的脊椎动物模型［7-9］。

β-高效氯氰菊酯（beta-cypermethrin）属Ⅱ型拟除虫菊酯类农药，化学名为（R，S）-α-氰基-3-苯

氧基苄基（1R，3R）-3-（2，2-二氯乙烯基）-2，2-二甲基环丙羧酸酯。因其具有高效、安全、杀虫谱广、低残留等特点，被广泛用于农业生产，但它对鱼类具有高毒性，很多国家对其用量进行了严格控制。

本研究是以脊椎动物斑马鱼为材料，分别从表型和蛋白质组水平两方面，对高效氯氰菊酯农药所引起的发育毒性及毒性机制进行探究，填补高效氯氰菊酯农药引起发育毒性的数据短缺，为进一步探究该农药对斑马鱼胚胎的发育毒性机制提供数据和线索；也为完善的环境污染物的评估标准提供理论依据。本研究首次通过荧光差异双向凝胶电泳（Fluorescence difference gel electrophoresis，DIGE）与基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）鉴定相结合的技术，探索高效氯氰菊酯对斑马鱼胚胎的发育毒性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

AB品系斑马鱼由北京大学张博实验室惠赠。

1.1.1 主要试剂 处理液：用丙酮作溶剂配制浓度为0.1 kg/L的β-氯氰菊酯储液，再用培养液稀释到0.1 mg/L。 链酶蛋白酶溶液：用E3 培养液配制终浓度为1 mg/mL的链酶蛋白酶（pronase，Sigma）溶液。于37℃温育2 h，溶解后贮存于-20℃备用。裂解液：7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%CHAPS（3-［（3-胆固醇氨丙基）二甲基氨基］-1-丙磺酸），40 mmol/L DTT（二硫苏糖醇），2%IPG buffer（pH4-7）。DTT与IPG buffer在临用前加入。水化液：7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，2% CHAPS，0.002% 溴酚蓝（1%），2% DTT，0.5% IPG buffer（pH4-7）。DTT与 IPG buffer在临用前加入。SDS平衡液储液：6 mol/L尿素，2% SDS（十二烷基磺酸钠），50 mmol/L Tris（三氢甲基氨基甲烷），29.3%甘油，0.002% 溴酚蓝（1%）。10X去卵黄缓冲液：55 mmol/L NaCl，1.8 mmol/L KCl，1.25 mmol/L NaHCO3。胶母液：30%丙烯酰胺，0.8%N，N’-甲叉双丙烯酰胺。使用前用0.45 μm滤膜过滤溶液，4℃避光保存。上槽电泳缓冲液：25 mmol/L Tris，192 mmol/L甘氨酸，0.2% SDS。下槽电泳缓冲液：25 mmol/L Tris，192 mmol/L甘氨酸，0.1% SDS。染色液：0.12% G-250，10% 硫酸胺，10% 磷酸，20% 甲醇。

1.1.2 仪器 斑马鱼独立养殖系统（北京爱生）、Ettan IPGphor Ⅲ等电聚焦系统（GE Healthcare）、Ettan DALT Large垂直电泳系统（GE Healthcare）、ImageScanner（GE Healthcare）、Typhoon 9000（GE Healthcare）。

1.2 方法

1.2.1 斑马鱼养殖 使用北京爱生公司开发的斑马鱼独立养殖设备，对斑马鱼进行规范化的饲养，设备包括丰年虾孵化系统、循环水系统、充气系统、紫外线杀菌系统和灯光照明系统，满足斑马鱼养殖的一切条件需要。鱼房使用自动计时器控制光照，保持14 h 光照/10 h 黑暗，控制室内温度28℃。自来水经净化处理后存储于加药桶内，并加入适量的NaCl，保持电导率为500 μs/cm，pH值为7.0。受精后5 d（5 dpf）幼鱼可进食草履虫。13 dpf后，逐渐喂食新鲜丰年虾，每天喂食3次，根据斑马鱼的发育大小及浓度进行适量喂养。

1.2.2 斑马鱼喂繁殖 斑马鱼按照雌雄比例为1∶1放入孵化盒中，用隔板分开，次日抽掉隔板，10 min后斑马鱼开始产卵，30 min后进行胚胎的收集，放于 28℃的培养箱中。

1.2.3 样品的处理 受精后3 h（囊胚期），利用不同浓度的高效氯氰菊酯农药对胚胎进行染毒处理，每个培养皿中放200胚胎，每3 h更换溶液，并及时去除死卵，在受精后48 h时，收集胚胎。

1.2.4 样品制备及蛋白质的提取

（1）去卵膜和卵黄 用1X链霉蛋白处理胚胎5-10 min，约2/3的卵膜脱落时，转移到含有去离子水的培养皿中，再用移液枪吸打，去除卵膜。再加去卵黄缓冲液1 mL，振荡5 min后300 r/min离心30 s，弃上清。加150 μL 3%SDS，90℃溶解5 min。

（2）蛋白质提取和定量 蛋白质提取采用甲醇-氯仿法，在上述溶液分别入4倍体积甲醇，1倍体积氯仿及3倍体积超纯水，充分混匀，14 000 r/min离心1 min，去掉上层溶液，再加4倍体积甲醇，混匀，14 000 r/min，离心2 min。吸掉甲醇，干燥沉淀。加适当体积裂解液（未添加DDT与IPG buffer）。蛋白质含量的测定采用2-DQuant Kit（GE Healthcare），

用紫外分光光度计测定480 nm波长下溶液的吸光率。绘制标准曲线，计算蛋白质含量。

1.2.5 样品标记 样品标记采用CyDye DIGE最小标记法。根据400 pmol 染料标记50 μg 蛋白的原则设计3个组，Cy2标记内标组（对照组25 μg+处理组25 μg），Cy3标记对照组（50 μg），Cy5标记处理组（50 μg），调溶液pH为8.5。将染料工作液1 μL加到50 μg蛋白质中，涡旋混匀，离心，冰上并暗处标记30 min。加入10 mmol/L 1 μL赖氨酸进行淬灭，涡旋混匀，离心，冰上并暗处淬灭15 min。标记完成，样品在-70℃下可以保存3个月。

1.2.6 2D-DIGE （1）水化：将由Cy2、Cy3和Cy5标记的样品进行充分混合，再用水化液将体积补到450 μL。加到水化泡胀盘中，将24 cm IPG干胶条（pH4-7）胶面向下置于胶槽内，样品与胶面充分接触且不能产生气泡，加覆盖油。室温水化时间约为20 h。（2）等电聚焦：把水化后的胶条转移到聚焦盘上，胶面向上，加覆盖油，在胶条两边压上电极，开始聚焦。聚焦条件见表1。（3）胶条平衡：等电聚焦结束，将胶面置于10 mL平衡液Ⅰ（含有100 mg DDT）中，平衡15 min，再转移到10 mL平衡液Ⅱ（含有400 mg碘乙酰胺）中，平衡15 min。（4）SDS-PAGE：平衡结束后，将胶条背面置于12.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶的顶端的玻璃板上，加入热的0.5%琼脂糖进行封口，让胶条与胶面充分接触且不能产生气泡。待琼脂糖凝固，装模具。电压为1-2 W/胶，40 min 后调至5-10 W/胶。当溴酚蓝迁移到胶的底部时结束电泳。（5）固定：聚焦结束后，将胶放在固定液中，固定30 min后用去离子水洗4-5次。（6）考马斯亮蓝染色：水洗后的胶在染色液中过夜染色。染色结束，用去离子水洗脱5次，可以得到背景较高的胶图。

1.2.7 凝胶的扫描与图像分析 普通双向利用ImageScannerⅡ扫描仪（GE Healthcare，USA）在透射模式和分辨率300 dpi条件下进行图谱的扫描，荧光凝胶用Typhoon FLA 9000（GE Healthcare，USA）进行扫描，3种染料的激发波长分别是Cy2：489 nm、Cy3：550 nm和 Cy5：649 nm。通过优化PMT值来采集图像，PMT值的范围要控制在6 000-10 000之间，本试验PMT在8 500左右。利用DeCyder 7.2软件分析，获得不同处理组样品差异表达蛋白点的信息。

表1 等电聚焦条件

2 结果

2.1 高效氯氰菊酯对斑马鱼形态学的影响

本试验选用4个特定的时间点（t=24 hpf、48 hpf、60 hpf、72 hpf）对暴露在不同高效氯氰菊酯溶液浓度里的斑马鱼胚胎或仔鱼发育定期进行观察，与对照组相比较，可以发现斑马鱼胚胎在24 hpf时，在形态上没有观察到明显的异常。而在48 hpf以后，经高效氯氰菊酯溶液处理的胚胎会表现出不同程度的毒性反应，包括体轴弯曲（图1-B、E和F），心包囊肿（图1-D）、独眼（图1-C）和死亡（图1-G和H）。随着高效氯氰菊酯溶液浓度的增加，表现出来的毒性反应也显著增强。在低浓度下（0.05 和0.1mg/L），只是表现部分畸形，而在高浓度下（0.2、0.6、1 mg/L），畸形率会大大增加，并伴有少量致死现象。本试验对畸形率进行统计，不同（0.05、0.1、0.2、0.6和1 mg/L）浓度处理组中，其畸形比例分别为14%、42%、80%、83.3%和86.7%。结果表明，随着高效氯氰菊酯农药浓度的增加，致畸性会显著增加，呈现一定的时间-剂量依赖性。由于0.1 mg/L浓度下，畸形率显著增加，故选此浓度进行后续试验。

2.2 双向电泳的优化

进行2D-DIGE之前，需要用普通双向电泳对整个流程进行条件优化，如图1所示。为了选择合适的胶条，本试验首先选用pH3-10范围的胶条进行预试验，如图2-A所示，在此图中，蛋白质点主要集中在左侧区域内，不是均匀分布在整张胶图上，

故pH3-10的胶条不适合本样品。选用pH 4-7的胶条（图2-B，C，D），根据蛋白质点的分布情况可得出，pH4-7的胶条适合本试验。但图2-B上部区域出现高背景并伴有纵向拖尾现象。根据此类情况，将除盐步骤进行了优化，设计了3步梯度除盐，分别为500 V 1 h，1 000 V 2 h，3 000 V 2 h。图2-C中出现水平的条纹或不完全聚焦的点，这种情况是由于聚焦时间不够造成的，该图中聚焦电压为7 500 V 9 h。经过一个完整的优化过程，得到分离效果比较好的图谱如图2-D所示，适合该样品的等电聚焦条件如表1所示。

图1 高效氯氰菊酯对斑马鱼胚胎形态的影响

2.3 2D-DIGE及质谱分析

利用优化好的双向电泳条件进行DIGE试验。DIGE图谱如图3所示，由于荧光标记的不同，所呈现的图谱也不同，Cy2标记的内标组为蓝色（图3-B），Cy3标记的对照组为绿色（图3-C），Cy5标记的处理组为红色（图3-D），3种荧光图的组合如图3-A所示。

图2 普通双向电泳图

图3 DIGE胶图

DeCyder 7.2蛋白分析软件进行识别并分析得出结果，以fold＞1.5和fold＜-1.5为标准，得到72个差异表达蛋白质，选取这些差异蛋白点并进行质谱分析，由于某些蛋白点丰度较低等原因最终成功鉴定出11个蛋白点，这些蛋白点的位置如图3所示。差异表达蛋白质质谱分析，见表2。

图3 11个差异蛋白点在双向电泳凝胶图谱的对应编号及位置

表2 斑马鱼胚胎的差异蛋白点质谱鉴定结果

3 讨论

DIGE是功能蛋白质组学研究的有力工具，通过对不同蛋白质表达差异分析，在研究疾病的分子机理［10-12］、分子诊断［13，14］、药物作用机理［15］、毒理学［16-19］等方面都有广泛的应用。是蛋白质组学研究中可信度和准确率最高的技术之一。

本试验成功鉴定了11种蛋白质：（1）HSPA8/ HSC70 蛋白（Heat shock cognate 71 kD protein）是腺苷三磷酸酶，它的主要作用是与辅助蛋白共同去除网格蛋白涂层囊泡，它也是热休克蛋白家族中的重要成员，在细胞内膜中参与蛋白质翻译折叠及运输［20］。（2）角蛋白，Ⅰ型细胞骨架（Keratin，type I cytoskeletal 18），它的磷酸化产物在纤丝重组中起重要作用［21］，与突变的囊性纤维化跨膜调节因子在质膜中的传递有关［22］，和细胞角蛋白共同参与白细胞介素-6（IL-6）-介导的屏障保护［23］。（3）40S核糖体蛋白质SA（40S ribosomal protein SA）作为层粘连蛋白细胞表面的受体，参与40S核糖体蛋白质的合成过程［24］。（4）-（6）肌动蛋白（Actin，cytoplasmic 2）是一个多基因家族蛋白，作为微丝的主要成分是重要的骨架蛋白，肌动蛋白和肌球蛋白一起构成了心肌、骨骼肌和平滑肌的主要收缩蛋白。（7）DNA裂解酶（DNA-lyase）作为一种无嘌呤/脱嘧啶（AP）脱氧核糖核酸内切酶，参与DNA氧化和烷基化所致病变中的碱基切除修复过程［25］。（8）26S 蛋白酶体（26S proteasome）依赖ATP参与泛素的降解，在双链断裂反应中起重要作用［26］。（9） Rho GTP酶（Rho GDP-dissociation inhibitor 1）是细胞内多条信号转导通路的关键分子，作为分子开关在胞内信号转导中发挥桥梁作用。Rho GTP酶可参与对正常细胞增殖、分化、凋亡的调节，并与肿瘤的发生和转移密切相关。试验研究发现，在多种肿瘤中可见Rho GTP酶异常表达，改变细胞内Rho GTP酶的表达水平可以直接影响肿瘤细胞侵袭和转移的过程［27］。（10）tdrd3（Tudor domain-containing protein 3）专门识别并结合含有二甲基精氨酸的蛋白质，与转录激活相关联［28］。（11）翻译控制肿瘤蛋白（Translationally-controlled tumor protein homolog）是与肿瘤生长相关的蛋白，参与重要的生物学过程，包括调节细胞周期的进程、细胞生长分化及精子发生和恶性转移、钙结合蛋白、细胞外组胺释放蛋白、抗凋亡及抗疟疾作用。还有研究表明，翻译控制肿瘤蛋白在人体肿瘤组织中的表达远高于正常组织［29］。

综上所述，这些蛋白在生命活动发挥着非常重要的作用，有些蛋白质（如Rho GTP酶、翻译控制肿瘤蛋白）的差异表达可能引起斑马鱼胚胎本身的病变，而某些蛋白质（角蛋白、DNA裂解酶）却是对应激反应做出来的修复与防御。

本研究结果表明高效氯氰菊酯农药对斑马鱼胚胎发育具有严重的毒性作用，较低浓度的高效氯氰菊酯溶液即已对斑马鱼胚胎在蛋白分子水平产生严重的潜在危害，影响胚胎的正常发育。本研究从分子水平上揭示了高效氯氰菊酯对斑马鱼胚胎的发育毒性及可能的毒害作用方式，为深入研究高效氯

氰菊酯对斑马鱼胚胎的发育毒性机理提供了证据和线索。

4 结论

高效氯氰菊酯农药对斑马鱼胚胎具有严重的神经毒性，并且对孵化后的幼鱼卵黄、体轴等表现出严重的致畸效应，在一定浓度下呈明显的时间剂量依赖性，高浓度的高效氯氰菊酯农药对会胚胎发育有严重影响。首次利用双向荧光差异凝胶电泳与质谱相结合的技术，得到高效氯氰菊酯农药胁迫下所引起的差异表达蛋白质，该结果为进一步研究高效氯氰菊酯农药对斑马鱼胚胎的发育毒性奠定了基础。

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（责任编辑 李楠）

Toxicity of Beta-cypermethrin for Zebrafish Embryos

Wang Jian Liu Lili Yu Kaimin Li Guochao Wu Wei Yan Yanchun
（Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

Beta-cypermethrin, an insecticide of type II pyrethroids, is highly toxic to fish and other aquatic organism and the residues can be detected in many foods. The impact of beta-cypermethrin for human health can not be neglected. To better define the toxicity mechanism of beta-cypermethrin for fish and human, the embryos of zebrafish were exposed to different sub-lethal concentrations of 0.05, 0.1, 0.2, 0.6 and 1 mg/L of beta-CYP solutions. With the help of a microscope, we observed the morphological changes. The results displayed that exposed to beta-CYP caused the embryonic toxicity increased in a dose-dependent manner. We chose zebrafish embryos exposure to beta-CYP（0.1 mol/L）as a model system to investigate the toxic effects on early development. A two-dimensional difference gel electrophoresis（2-D DIGE）coupled with MALDI-TOF-MS/MS analysis was employed to detect and identify the differential expressed proteins. In the present study, a total of 11 different proteins were successfully identified, which were mostly associated with cytoskeletal, stress response and metabolism. This study brings useful information and contributes to a better understanding about the embryo toxicity organisms of beta-CYP.

Zebrafish Embryos Beta-cypermethrin DIGE MALDI-TOF-MS/MS

2014-02-19

国家自然科学基金项目（31170119），中国农业科学院基础研究基金项目（0042014006，0042014011，0042012003，0042011006）

王健，男，硕士研究生，研究方向：微生物分子生物学与基因工程；E-mail：xwj329396369@gmail.com

闫艳春，女，教授，研究方向：微生物分子生物学与基因工程；E-mail：yanyanchun@caas.cn