凉粉草中天然有机酸化学成分的研究

李湧，余巍，马燕娟，赵永锋，杨健，刘军义，郑玲，*

（1.广西出入境检验检疫局技术中心，广西南宁530021；2.桂林聚果园果汁有限公司，广西桂林541000）

凉粉草中天然有机酸化学成分的研究

李湧1，余巍1，马燕娟1，赵永锋1，杨健2，刘军义1，郑玲1，*

（1.广西出入境检验检疫局技术中心，广西南宁530021；2.桂林聚果园果汁有限公司，广西桂林541000）

通过碱性溶液提取、高效液相色谱分离测定，在植物凉粉草中分离鉴定出一种新的天然有机酸成分-苯甲酸。样品经处理后，使用3种不同的色谱柱，在不同的色谱条件下，均呈现出与苯甲酸标准品相同的保留时间，待测物与标准苯甲酸的光谱图也完全相符，证实了植物凉粉草中天然苯甲酸的存在。本方法首次利用高效液相色谱法对植物凉粉草中的天然有机酸化学成分-苯甲酸进行分离鉴定。可为其他植物中天然有机酸化学成分的鉴定提供参考。

凉粉草；苯甲酸；高效液相色谱

凉粉草（Mesona chinensis Benth），别名仙人草、仙人冻、薪草、仙草，为唇形科凉粉草属一年生草本植物[1]。在中国主产于南方各省及台湾南部，印尼和越南也有广泛分布和较大产量。2010年3月，国家卫生和计划委员会发布[2010年]第3号公告，允许凉粉草（仙草Mesona chinensis Benth.）作为普通食品生产经营[2]，凉粉草被列入中国药食同源植物目录。

凉粉草作为重要的药用和食用植物资源，含有丰富的营养成分、具有特殊的医疗功效，是天然、安全、保健、营养食品较理想的原料，其加工利用价值非常广泛，近年来发展规模不断扩大。由凉粉草为主要原料制成的仙草冻和龟苓膏等中式传统甜点深受广大消费者喜欢，在华南、港台区域及东南亚国家很流行；市面上流行的包装凉茶饮料品牌，例如王老吉、加多宝、和其正、杨协成及晨光等品牌凉茶饮料配料表中都含有仙草成分，对凉粉草的研究已成为热点。

研究显示，凉粉草中含有碳水化合物、蛋白质、氨基酸、脂肪、维生素、色素、酚类、三萜酸、黄酮、多糖等营养成分，同时含有钙、锌、铁、锰、钾等矿物质元素[3]。对凉粉草中黄酮类、多糖、三萜类、色素、挥发油等[4-8]已有较深入研究，但未见对凉粉草中天然有机酸化学成分的研究。

苯甲酸作为一种天然有机酸化合物，在自然界植物成分中广泛分布，是植物的活性成分之一[9]，例如半夏、马齿苋、红芽大戟、白蒺藜、板蓝根[10-14]等中药材中均含有天然苯甲酸成分。有文献[15]报道：板蓝根中含有的苯甲酸等有机酸成分具有有较强抗内毒素活性。

本文采用高效液相色谱法对凉粉草提取物进行分离测定，通过与标准物质进行对照，证明在凉粉草中天然含有微量有机酸——苯甲酸，对凉粉草食疗机理深入研究和资源进一步科学开发利用具有积极意义。

1 材料

1.1 原料和试剂

干凉粉草（全草）：购自广西灵山县。当年产，无病害，经除杂、清洗、晾干、切段、粉碎和过筛后备用。

标准品：苯甲酸（1.00mg/L），购自中国计量科学研究院；甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）；其余试剂均为分析纯，水为去离子水。

1.2 仪器

Agilent1200型高效液相色谱仪（配二极管阵列检测器DAD）：美国Agilent公司；Milli-Q Reference超纯水器：美国Millipore公司；PHS-3C型精密PH计：上海雷磁仪器厂；KQ-400DB型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；Anke DL-5-B型离心机：上海安亭科学仪器厂。

2 方法

2.1 提取方法

称取0.50 g凉粉草试样，置于50mL离心管中。加入0.6%氢氧化钠溶液30mL，混匀，浸泡30min，再于40℃超声提取40min，4 000 r/min离心10min，得提取液。

取提取液10mL，加入6mol/L的盐酸溶液1mL，混匀，用10mL乙醚超声提取20min，4 000 r/min离心，将乙醚层转移至25mL刻度试管中，残渣再用10mL乙醚同前提取1次，合并提取液，定容至20mL。加入1mL酸性氯化钠溶液，振摇2min，离心，取5mL乙醚提取液于40℃氮气吹干，用1mL水定容，过0.45μm滤膜，得测试液。

2.2 分析方法

将测试液分别采用ZORBAX Eclipse XDB-C18（5μm，4.6mm i.d.×250mm）、ZORBAX SB-Aq（5μm，4.6mm i.d.×250mm）和Poroshell 120 EC-C18（2.7μm，4.6mm i.d.×100mm）3种色谱柱进行测定，并与苯甲酸标准物质进行对照。其余条件为：流动相：V（甲醇)：V（20mmol/L的乙酸铵溶液）=5∶95；流速：1mL/min；柱温：40℃；检测波长：230 nm。

分别以5∶95；10∶90；15∶85；20∶80；25∶75；30∶70的V（甲醇)：V（20mmol/L的乙酸铵溶液）为流动相对测试液进行测定，并与苯甲酸标准物质进行对照。其余条件为：色谱柱ZORBAX Eclipse XDB-C18（5μm，4.6mm i.d.×250mm）；其它条件同上。

利用二极管阵列检测器测定测试液中与标准苯甲酸保留时间一致的化合物的光谱图，并与苯甲酸标准物质进行对照。

3 结果与分析

3.1 不同色谱柱的分析研究

高效液相色谱作为广泛使用的分离测定方法，对未知化合物的定性一般必须使用标准物质进行对照。如化合物峰与标准物质峰的保留时间一致，则可认为该化合物与标准物质相同。本研究将待测溶液分别采用ZORBAX Eclipse XDB-C18（5μm，4.6mm i.d.×250mm）、ZORBAX SB-Aq（5μm，4.6 mm i.d.×250 mm）和Poroshell 120 EC-C18（2.7μm，4.6mm i.d.×100mm）3种色谱柱进行测定，并与苯甲酸标准物质进行对照，结果显示，在分离良好的情况下，待测溶液中均有与苯甲酸标准物质保留时间一致的峰，因此，可确定该待测溶液中含有苯甲酸。在各色谱柱上的分离的液相色谱图见图1、图2和图3。

图1 在ZORBAX Eclipse XDB-C18柱的液相色谱图Fig.1 Chromatograms on ZORBAX Eclipse XDB-C18

图2 在ZORBAX SB-Aq柱的液相色谱图Fig.2 Chromatograms on ZORBAX SB-Aq

图3 在Poroshell 120 EC-C18柱的液相色谱图Fig.3 Chromatograms on Poroshell 120 EC-C18

3.2 不同比例流动相的分析研究

在使用液相色谱测定样品时，如遇到较复杂样品，单一的流动相条件不能对其进行定性的时候，通常通过改变流动相的比例重新测定。流动相的比例不同，洗脱能力不同，则化合物的保留时间也会改变。改变流动相比例，如待测物保留时间与标准物质不一致，则可判定不是同一种物质；反之，无论流动相比例如何变动，保留时间始终与标准物质相同，则可判定为同一种物质。本研究采用ZORBAX Eclipse XDB-C18（5μm，4.6mm i.d.×250mm）色谱柱，分别以5∶95；10∶90；15∶85；20∶80；25∶75；30∶70的V（甲醇）∶V（20mmol/L的乙酸铵溶液）为流动相对待测溶液进行测定，并与苯甲酸标准物质进行对照，结果显示，在各不同比例的流动相条件下，均有与苯甲酸标准物质保留时间一致的峰，因此，可确定该待测溶液中含有苯甲酸。在不同流动相比例下的色谱图见图4～图9。

图4 流动相比例为5∶95时的液相色谱图Fig.4 Chromatograms at Mobile phase ratio is5∶95

图5 流动相比例为10∶90时的液相色谱图Fig.5 Chromatograms at Mobile phase ratio is10∶90

图6 流动相比例为15∶85时的液相色谱图Fig.6 Chromatograms at Mobile phase ratio is15∶85

图7 流动相比例为20∶80时的液相色谱图Fig.7 Chromatograms at Mobile phase ratio is20∶80

图8 流动相比例为25∶75时的液相色谱图Fig.8 Chromatograms at Mobile phase ratio is25∶75

图9 流动相比例为30∶70时的液相色谱图Fig.9 Chromatograms at Mobile phase ratio is30∶70

3.3 化合物吸收光谱测定

二极管阵列（DAD）检测器，由于具有测定化合物吸收光谱的功能，在液相色谱的检测器中比紫外检测器应用更为广泛。在化合物与标准物质保留时间一致的情况下，如化合物与标准物质的光谱图不一致，则有可能不是同一种物质，或至少该化合物峰不纯，不能判定为同一种物质。本研究中，待测溶液中与苯甲酸保留时间一致的化合物，其光谱图与标准苯甲酸完全一致，因此，可确定该待测溶液中含有苯甲酸。标准苯甲酸和待测物的光谱图见图10。

4 结论

苯甲酸作为一种天然有机酸化合物，在自然界植物成分中广泛分布，是植物的活性成分之一。本文采用高效液相色谱法对凉粉草提取物进行分离分析，通过与苯甲酸标准物质进行对照，首次证明在凉粉草中天然含有微量有机酸——苯甲酸，可为其他植物中天然有机酸化学成分的鉴定提供参考，对凉粉草食疗机理深入研究和资源进一步科学开发利用具有积极意义。

图10 液相色谱二极管阵列（DAD）检测器测定的光谱图Fig.10 Spectrogram detected by DAD

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Natural Organic Acid from Mesona Chinensis Benth

LI Yong1，YU Wei1，MA Yan-juan1，ZHAO Yong-feng1，YANG Jian2，LIU Jun-yi1，ZHENG Ling1，*
（1.Guangxi entry-exit Inspection and Quarantine bureau，Nanning 530021，Guangxi，China；2.Guilin Suntaste Juice Co.，Ltd.，Guilin 541000，Guangxi，China）

Benzonic acid，anew natural component discovered from Mesona chinensis Benth，was extracted with basic aqueous solution and determined by high performance liquid chromatography for the first time.The target compound was proved to be natural benzonic acid under different condition of HPLC，such as the choice of chromatogram columns，the mobile phase proportion and the spectrogram.The reported approach will be supplied for determination of natural organic acid for other plants.

Mesona chinensis Benth；benzonic acid；high performance liquid chromatography

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.16.009

2013-03-07

李湧（1980—），男（汉），工程师，学士，研究方向：仪器分析。

*通信作者