响应面法优化放线菌产纤维素酶发酵条件

曾柏全，许志，张阳阳

（中南林业科技大学生命科学与技术学院，湖南长沙410004）

响应面法优化放线菌产纤维素酶发酵条件

曾柏全，许志，张阳阳

（中南林业科技大学生命科学与技术学院，湖南长沙410004）

采用紫外与60Co-γ射线诱变获得的高产纤维素酶菌株系为研究对象，研究产纤维素酶的发酵条件，结果表明：通过单因素实验，确定复合碳源，蛋白胨，KH2PO43个因素的取值范围。利用SAS9.1软件对碳源、氮源以及KH2PO4进行响应面分析。结果表明：X1（氮源）=4.05g，X2（复合碳源）=3.69g，X3（KH2PO4）=4.68%，CMCase最大酶活为94.8688IU/mL。

放线菌；纤维素酶；响应面

纤维素类物质是自然界中存在的最廉价、最丰富的一类可再生资源[1]。纤维素酶（celluase）可广泛用于食品、纺织、造纸、洗涤、饲料、酿酒、石油勘探、中药成分提取、生物能源等众多领域，特别是在纺织、洗涤、造纸和生物能源等工业应用上具有重要地位[2-3]。肖舫[4]等通过对发酵条件优化，使羧甲基纤维素钠活性达到1.548 IU/mL。陈伟红[5]经过诱变选育后进行发酵条件优化将FPAase酶活提高到40.8 IU/mL。佟勇[6]等筛选出嗜热放线菌，并对其进行发酵条件优化，获得较高的纤维素酶活。目前，大量的纤维素物质没有被利用，运用纤维素酶对纤维素进行充分利用，将农副产品如糠醛渣、蔗糖渣、造纸废料等纤维素材料转化成糖和蛋白质，对缓解全球能源危机，食品和饲料资源紧张以及环境污染有着重大意义[7]。本实验鉴于纤维素酶酶活不高，纤维素酶供不应求，对产酶发酵条件进行优化，来提高纤维素酶活。

1 材料与方法

1.1 培养基

斜面培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20 g，水1 000mL；筛选培养基：CMC-Na 20 g，（NH4）2SO42.0 g，MgSO4·7H20 0.5g，KH2PO41 g，NaCl0.5 g，刚果红0.4 g，琼脂20 g，水1 000mL；发酵产酶培养基：蛋白胨3.0 g，酵母浸出膏0.5 g，（NH4）2SO42.0 g，KH2PO44.0 g，CaCl20.3 g，MgSO4·7H20 0.3 g，CMC-Na 20 g，水1 000mL。

1.2 主要实验仪器

全自动高压蒸汽灭菌器：DAIHAN LABTECH Co.，LTD；SW-CJ-1F型水平超净工作台：江苏苏净集团安泰公司；PYX-280S-A型生化培养箱：宁波江南仪器厂；TGL-16高速台式冷冻离心机：湘江仪器厂；UV-1700紫外可见分光光度计：日本岛津公司；60Co-γ放射仪：湖南省原子能研究所。

1.3 实验方法

1.3.1 培养方法

将菌株由斜面接种到50mL种子培养基的250mL锥形瓶中，于30℃，175 r/min的条件下培养3 d。然后按4%的接种量接入装有60mL产酶培养基的250mL锥形瓶中，于30℃、180 r/min的条件下培养6 d。

1.3.2 纤维素酶活力的测定

酶活测定均用DNS法[8]测定酶解产生的还原糖量，酶活单位采用国际定义[9]方法：其中CMC酶活和FPA酶活在50℃，pH6.0条件下，以1mL酶液1min分解底物生成1μmol葡萄糖的酶量定义为1个酶活单位。

2 结果与分析

2.1 发酵条件优化

2.1.1 分析因素的选取以及分析方案

通过复合诱变的初筛与复筛最终得到突变株UV-Co16，以此菌株进行后续试验。经过单因素实验选取对发酵条件影响较大的碳源、氮源、磷酸盐为自变量，并以+1，0，-1代表自变量的高，中，低水平，以CMCase为响应值。实验因素和水平设计见表1，实验方案以及结果见表2。

表1 响应面分析因素与水平表Table1 Factors and Levels for Box-Behnken design

表2 响应面分析方案及实验结果Table2 Program and experimental results of Box-Behnken design

2.1.2 回归方程的建立与分析

利用SAS9.1软件（Analysis of variance）ANOVA程序对表3数据进行二次回归分析，结果见表3，剔除不显著的影响因素，即影响因素的P＜0.05，得到响应值（Y1）CMCase酶活的回归方程为：Y1=8 792.935+ 971.895 6X1+1180.741X2+863.428 9X3-2 166.05X1X1-1 048.935X1X3-2 397.818X2X2-2 818.473X3X3。

表3 CMCase的ANOVA分析结果Table3 Results of ANOVA for the activity of CMCase

回归方程中，变量的正系数表明该变量的正向增大可以引起响应值的增大；负的二次项系数表明回归方程的曲面的开口方向向下，具有极大值点，能够进行最优分析。在Y1模型中F值为20.707 65，P= 0.001 924＜0.05，说明此模型显著。由回归方程可以看出，3个因素对响应值的影响不是简单的线性关系。由表4可以看出，依据F值可知，3个因素对Y1值的影响为X2＞X1＞X3；模型的失拟性检验拟P=0.327 152＞0.05，失拟项不显著，说明此模型的回归方程对实验拟合较好，模型能准确地模拟个因素对CMCase的影响；模型的决定系数R2=0.973 9，说明该模型能够很好的拟合97%的实验结果。

利用SAS9.1软件，通过所得的回归方程模型得到响应面分析图和等高线图如图1～图3所示。

当固定其中一个因素为0时，响应值会随着其他两个因素的增大而增大，当达到某一极大值后，继续增加，响应值反而下降。说明响应值Y1有极大值，利用SAS9.1软件，通过回归方程得出模型的极大值点，即：X1（氮源）=4.05 g，X2（复合碳源）=3.69 g，X3（磷酸盐）=4.68%，CMCase最大酶活为94.868 8 IU/mL。

2.2 最优条件的验证试验

图1 Y=f（X1，X2）响应面分析图和等高线图Fig.1 Surface plot and contour plot of Y1 between X1and X2

图2 Y=f（X1，X3）响应面分析图与等高线图Fig.2 Surface plot and contour plot of Y1 betweenX1and X3

图3 Y=f（X2，X3）响应面分析图与等高线图Fig.3 Surface plot and contour plot of Y1 between X2and X3

按照理论最优的外部产酶条件，做3次平行试验，后取平均值得到酶活为92.483 IU/mL与理论值相差不大，说明该模型能较好的拟合97%的实际实验数据。

3 结论

由本实验可以得出响应面分析所选取的3个因素：复合碳源，氮源，磷酸盐对整个发酵产酶过程影响显著，为不可缺少的条件。并且复合碳源对整个发酵产酶影响最大，蛋白胨次之，最后为磷酸盐。通过SAS9.1软件得出本菌株的最优发酵产酶条件为：X1（氮源）=4.05g，X2（复合碳源）=3.69g，X3（磷酸盐）= 4.68%，CMCase最大酶活为94.868 8 IU/mL。

4 讨论

从整个优化实验结果可以看出，复合碳源对发酵产酶的影响最大，这也验证了大多试验的试验结果：对于产纤维素酶的菌株，碳源不仅仅作为碳源，更是很好的诱导剂，可以促进纤维素酶的产生。本实验中磷酸盐也对发酵产酶有显著影响，这与一般的微生物代谢教科书中的适量的磷酸盐可以通过促进菌体的生长从而促进酶量的增加[10]。

[1]张加春,易琴,黄遵锡.纤维素酶曲的浅盘生产研究[J].云南师范大学学报：自然科学版,2002(2)：50-52

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[3]Rajesh K,Bund,Rekha S.An alkais Table cellulase by chemical modification using maleic anhydride[J].Carbohydrate Polymers,2002,47：137-141

[4]肖舸,雷芳,喻东,等.一株产纤维素酶绿色木霉的筛选及发酵条件优化[J].四川大学学报,2004(41)：422-425

[5]陈伟红.诱变处理筛选纤维素酶高产菌株以及发酵条件优化[D].陕西：西北农林科技大学,2007：49-65

[6]佟勇.产纤维素酶放线菌及其酶学性质[D].中国科学技术大学, 2004：6

[7]徐昶,龙敏南,邬小兵,等.纤维素酶菌株的筛选及产酶条件研究[J].厦门大学学报：自然科学版,2005,29(1)：107-111

[8]Carpenter S.Waterloo region green home[J].A SHRA E Journal, 1996,38(10)：43-46

[9]TKG HOSE.Measurement of cellulase activity[J].Pure&Appl Chem, 1987,59(2)：257-268

[10]杨汝德.现代工业微生物学[M].广州：华南理工大学出版社,2001：352-356

Optimization of Fermentation Conditions for Cellulase Production of Actinomycetees by Response Surface Analysis

ZENG Bai-quan，XU Zhi，ZHANG Yang-yang
（College of Life of Science and Technology，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004，Hunan，China）

Study fermentation conditions，an excellent cellulase-producing strain，which was screened by UV and60Co-γray was researched.The ranges of mixture carbon，peptone，KH2PO4were confirmed through single factor experiment.Carbon and Nitrogen sources and KH2PO4were analysised in response surface by using of SAS9.1 software.The results showed that mixture carbon 3.69 g，Nitrogen 4.05 g，KH2PO44.68%，the max cellulase activity was 94.868 8 IU/mL.

Actinomycetees；cellulase；response surface

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.16.026

2013-04-10

湖南省科技计划项目（2012NK3113）

曾柏全（1967—），男（汉），副教授，博士，主要从事生物活性物质及分子技术与资源研究。