血管内皮生长因子和E-cadherin在胃癌组织中的表达及临床意义

2014-03-21玄基泽陈丹时畅温志红王辉

中国医科大学学报 2014年4期

玄基泽，陈丹，时畅，温志红，王辉

（1.大连医科大学附属第一医院病理科，辽宁大连116011；2.大连市第五人民医院放射线科，辽宁大连116021；3.大连医科大学附属第一医院超声科，辽宁大连116011）

玄基泽1，陈丹1，时畅1，温志红2，王辉3

目的检测血管内皮生长因子（VEGF）及E-cadherin在胃癌组织中的表达，探讨其临床意义。方法采用荧光定量实时PCR定量分析病灶细胞中VEGF及E-cadherinmRNA转录量，Western blot分析VEGF及E-cadherin蛋白表达量，并采用免疫组化方法分析表达阳性率。结果胃癌组织和无癌胃黏膜组织中VEGF蛋白的阳性表达率分别为78.6%（44/70）和14.3%（4/34），E-cadherin蛋白的阳性表达率分别为22.9%（16/70）和91.4%（32/34）。VEGFmRNA在胃癌组织中的表达量高于无癌胃黏膜组织（P＜0.01），E-cadherinmRNA则相反（P＜0.01），且二者的表达量与肿瘤分化程度、淋巴结转移、浸润深度、TNM分期有关（P＜0.04）。结论胃癌组织中VEGFmRNA和蛋白的表达增加，E-cadherinmRNA和蛋白则减少；提示VEGF和E-cadherin的表达与胃癌的生物学行为有关，可能参与胃癌的发生、发展和侵袭转移。

胃癌；细胞增殖；细胞侵袭；血管内皮因子；E-cadherin

胃癌是消化系统中最常见的恶性肿瘤，严重威胁人类的健康，其发病率和死亡率较高，4年生存率较低。胃癌早期无特异的症状，难以诊断。胃癌致死病因大多是由于胃癌的侵袭和转移，约半数以上的患者在确诊时已经为晚期，四分之三以上的患者治疗后发生复发和转移。由于黏附因子的降解和癌细胞的黏附是导致肿瘤浸润和转移的主要原因［1，2］，因此本研究探讨血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和E-cadherin在胃癌中的表达，评价VEGF和E-cadherin表达的检测在诊断胃癌浸润、转移和评价预后中的临床价值。

1 材料与方法

1.1 标本来源

胃癌组织标本取材于2009-2013年于大连医科大学附属第一医院行胃癌手术的70例患者，其中男43例，女17例，年龄27～80岁，平均（46.4±4.7）岁。所有患者均行D2胃癌根治术，并且在术前未进行其他放化疗和抗肿瘤治疗。其中高、中分化腺癌24例，低分化腺癌44例。取上述标本中距癌组织10 cm以上切缘，免疫组化证实组织无癌浸润的无癌胃黏膜组织34例作为对照组。所有标本均经过4%中性甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚度切片，并经病理确诊。

1.2 实验仪器

高速台式离心机（德国Sigma公司）；310型CO2培养箱（美国Thermo公司）；蛋白电泳及电转系统、680型酶标仪（美国Bio-Rad公司）；倒置相差显微镜（日本Nikon公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 实时PCR（real-time PCR，RT-PCR）检测VEGF和E-cadherin的表达：实验用Trizol总RNA抽提纯化及RT-PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。利用GenBank检索及Primer 4.0软件设计引物，引物购自上海生工生物工程股份有限公司。VEGF上游引物：4′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物：4′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAG CA-3′，产物260 bp；E-cadherin上游引物：4′-TACAC TGCCCAGGAGCCAGA-3′，下游引物：4′-TGGCACC AGTGTCCGGATTA-3′，产物960 bp。退火温度分别为43℃和48℃，反应条件均为94℃下预变性4 min 30 s；94℃变性30 s；72℃延伸3 min，34个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物利用琼脂糖电泳鉴定，采集后应用分析软件对PCR产物进行光密度分析，以目的条带灰度值为指标评价胃癌组织及无癌胃黏膜组织的VEGF或E-cadherin的表达量。

1.3.2 Western blot：收集胃癌细胞并提取总蛋白。电泳（12%SDS-PAGE凝胶）、转印（80 V，120 min），4%正常小牛血清封闭，抗VEGF（1：1 000）、抗E-cadherin（1：800）及抗β-actin（1：200），4℃孵育过夜，分别于各自对应的二抗（1：2 400）室温孵育2 h，加入ECL显影剂，经自动电泳凝胶成像分析仪采集，进行灰度值测定。

1.3.3 免疫组化染色：采用SP试剂盒（美国Maxin公司）检测。石蜡切片在二甲苯及不同浓度的乙醇中常规脱蜡水化，切片浸泡在枸缘酸盐缓冲液中，置于水浴加热后室温冷却，之后用PBS漂洗。在过氧化氢中孵育后用PBS漂洗，封闭血清室温封闭后用PBS漂洗。滴加稀释的一抗，4℃孵育过夜后用PBS漂洗；用生物素标记的二抗室温孵育后用PBS漂洗；用HRP-Avdin室温孵育后用PBS漂洗。用DAB显色后镜下观察，待充分显色后终止反应，苏木素复染后用乙醇脱水，再用中性树脂封片。

1.4 结果判定

以PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性的胃癌组织切片作阳性对照。每张切片由2位不知晓患者临床病理资料的病理医师分别对染色结果进行判读，依照Fromowitz综合计分法，将阳性细胞百分数与细胞着色强度综合判定，阳性细胞百分数为10个视野阳性细胞数占细胞总数的百分比：＜4%计0分，4%～24%计1分，26%～40%计2分，41%～74%计3分，＞74%计4分；细胞着色强度：不着色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。二者积分相加：0～2分为阴性，＞2分为阳性，并计算阳性百分率。

1.5 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析，计量资料以表示。胃癌组织与无癌胃黏膜组织间的比较采用t检验，P＜0.04为差异统计学意义。

2 结果

2.1VEGF和E-cadherinmRNA的表达

VEGFmRNA在胃癌组织（0.79±0.13）中的表达量高于无癌胃黏膜组织（0.39±0.04），差异有统计学意义（P＜0.01）；E-cadherinmRNA的表达则呈相反趋势，即在无癌胃黏膜组织（0.87±0.14）中的表达量高于胃癌组织（0.07±0.02）（P＜0.01）。见图1。

图1 VEGF和E-cadherin mRNA的表达Fig.1 Expression of VEGF and E-cadherin mRNA

2.2 VEGF和E-cadherin蛋白的表达

VEGF在胃癌组织细胞核染色呈强阳性；在无癌胃黏膜细胞核中呈阴性或者弱阳性（图2）。胃癌组织中VEGF的阳性表达率明显高于无癌胃黏膜组织（P＜0.01），阳性表达率分别为78.6%（44/70）和14.3%（4/34）。E-cadherin在无癌胃黏膜组织中的表达呈强阳性，而在胃癌组织中呈阴性。无癌胃黏膜组织中E-cadherin的阳性表达率明显高于胃癌组织，阳性表达率分别为91.4%（32/34）和22.9%（16/ 70），两者差异有统计学意义（P＜0.01）。见图3。

图2 正常组织和胃癌组织中E-cadherin和VEGF的表达情况免疫组化×400Fig.2 VEGF and E-cadherin expression in normal tissue and gastric cancer tissue Immunohistochemistry×400

图3 VEGF和E-cadherin蛋白的表达Fig.3 Expression of VEGF and E-cadherin protein

2.3VEGF和E-cadherinmRNA表达与临床病理指标的关系

VEGFmRNA表达水平在细胞分化程度高、存在淋巴结转移、肿瘤浸润T3、T4及TNM分期Ⅲ～Ⅳ期患者的肿瘤组织中较细胞分化程度低、无淋巴结转移、肿瘤浸润T1、T2及TNM分期Ⅰ～Ⅱ期患者显著升高（P＜0.04）；而E-cadherinmRNA（P＜0.04）则相反。而且二者与患者性别、年龄及肿瘤大小均无关（P＞0.04）。见表1。

表1 VEGF和E-cadherin mRNA表达与临床病理指标的关系Tab.1 Relationship of VEGF and E-cadherin mRNA expression and clinicopathological parameters

3 讨论

侵袭和转移是恶性肿瘤的主要致死原因，因此对侵袭和转移的相关因子进行研究对肿瘤的治疗有着十分重大的意义。肿瘤的侵袭过程极其复杂，也是发生远端转移的起始。它主要与肿瘤细胞的黏附、运动、增殖以及肿瘤血管的形成有关。

在肿瘤的侵袭和转移过程中，肿瘤新生血管的形成过程是其中的关键因子之一。VEGF可以促进血管的形成，为肿瘤细胞提供营养物质，为侵袭和转移创造了适宜条件。VEGF作用于内皮细胞，主要通过以下3个方面的作用调控体内肿瘤血管的形成：促进血管内皮细胞增殖，刺激内皮细胞使血浆蛋白形成蛋白凝块，提高血管的管壁通透性。之前已有研究表明，VEGF在胃癌中呈高表达，而在正常胃黏膜上皮的表达呈阴性。研究表明，随着胃癌的分期和转移情况，VEGF呈不同程度的表达［3，4］。T3、T4期的表达高于T1、T2期，淋巴结转移组的表达高于非淋巴结转移组［4，6］。这都提示VEGF在胃癌的新生血管表现活跃，为肿瘤生长及转移的基础。而相应的肿瘤的发生和发展也会促进VEGF的表达过量，因此VEGF的表达与胃癌的侵袭和转移有着密不可分的相关性［7，8］。

此外，细胞的黏附系统也对癌细胞脱离原发灶有着重要的作用，癌细胞与细胞外基质发生黏附是肿瘤侵袭和转移的起始步骤。正常的细胞必须通过细胞黏附维持生长，而许多癌细胞可以无需黏附而呈现散落状态，并且不发生凋亡。导致这种状态的原因是因为癌细胞能诱导免疫细胞的凋亡。而细胞的运动、侵袭和转移是因为黏附与非黏附过程失去了平衡。当肿瘤发生局部浸润时，癌细胞之间的黏附能力降低。E-cadherin是介导黏附作用的因子之一，属于细胞膜的整合蛋白，在上皮细胞中分布广泛。它参与细胞间及细胞与基质间的作用，其表达异常会导致癌细胞脱离原发灶，发生转移和局部浸润。有研究表明，E-cadherinmRNA在胃癌中的表达明显低于正常胃黏膜上皮细胞［9～11］。并且其低表达与TNM分期、胃癌组织分化程度低及淋巴结转移的差异比较呈高度相关。还有文献报道E-cadherin基因（CDH1）与晚期胃癌中常见的杂合性缺失有关，与生存率低、预后较差紧密联系。该基因的异常表达主要与CDH1发生基因突变、异常的转录功能和翻译功能、甲基化的启动紧密相关，因此研究E-cadherin在组织中的表达可为临床分析肿瘤复发和转移提供可靠的诊断依据。

本研究检测胃癌组织和无癌胃黏膜组织中VEGF和E-cadherinmRNA和蛋白的表达情况，结果发现胃癌组织中VEGF的阳性表达率明显高于无癌胃黏膜组织（P＜0.01），无癌胃黏膜组织中E-cadherin的阳性表达率明显高于胃癌组织（P＜0.01）。为了进一步证实VEGF和E-cadherin在胃癌组织和无癌胃黏膜组织中的表达情况，又采用RT-PCR法对二者mRNA含量进行检测，结果发现VEGFmRNA在胃癌组织中的表达量高于无癌胃黏膜组织，差异有统计学意义（P＜0.01）；E-cadherinmRNA在无癌胃黏膜组织中的表达量高于胃癌组织（P＜0.01）。

结合以往及本研究结果，推测在胃癌的发生发展过程中有可能刺激了肿瘤血管内皮细胞的增殖，而细胞的黏附作用降低，所以导致了细胞的持续增殖和侵袭、转移。有关VEGF和E-cadherin与胃癌临床病理特征关系的研究较少。有研究表明，二者与胃癌的淋巴结转移、临床分期等有关。本研究发现，VEGF和E-cadherin的表达与肿瘤的分化程度、有无淋巴结转移、浸润程度和分期有关（P＜0.04），而与年龄、性别、肿瘤大小无关（P＞0.04），这可能是因为VEGF的增殖为肿瘤的侵袭和转移提供了有利的条件，而E-cadherin在胃癌组织中表达减少，导致细胞失去黏附能力而产生了高度的侵袭性，更易于转移。

综上，胃癌的侵袭和转移过程是一个多步骤、多因素的复杂的动态生物学过程，涉及到多种基因的细胞生物学行为的改变［12，13］。至今，相关的侵袭和转移机制取得了巨大的进展，但细胞内皮血管生长因子和细胞的黏附过程的机制尚不明了［14，14］。研究相关基因的功能为今后的靶点基因治疗提供了重要依据。

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（编辑陈姜）

Expression of Vascular EndothelialGrowth Factor and E-cadherin in Gastric Cancerand the ClinicalSignificance

XUANJi-ze1，CHENDan1，SHIChang1，WENZhi-hong2，WANGHui3
（1.DepartmentofPathology，The FirstAffiliated HospitalofDalian MedicalUniversity，Dalian 116011，China；2.DepartmentofRadiology，The Fifth People’s HospitalofDalian，Dalian 116021，China；3.DepartmentofUltrasound，The FirstAffiliated HospitalofDalian MedicalUniversity，Dalian 116011，China）

ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of vascular endothelial growth factor（VEGF）and E-cadherin in gastric cancer，and explore its clinicalsignificance.MethodsReal-time PCR and Western blotwere used to detectthe mRNA and protein expressions of VEGF and E-cadherin，and immunohistochemical method was used to analyze the positive rate.ResultsVEGF protein expression rates of gastric cancer tissue and normal tissue were 78.6%（44/70）and 14.3%（4/34），and the positive expression rates of E-cadherin protein were 22.9%（16/70）and 91.4%（32/34）respectively.The expression levels ofVEGFmRNA and protein were remarkably higher than those in control group（P＜0.01），and E-cadherin was opposed（P＜0.01）.Moreover，the expression levels were correlated with tumor differentiated degree，lymphatic metastasis，depth of invasion and TNM staging（P＜0.04）.ConclusionIn gastric cancer，the expression levels of VEGF was obviously increased and E-cadherin was decreased.Both VEGF and E-cadherin are involved in the appearance，progress and migration ofgastric cancer.

gastric cancer；cell proliferation；cell migration；vascular endothelial growth factor；E-cadherin

R734.2

0248-4646（2014）04-0324-04

辽宁省科学技术计划（2012224020）

玄基泽（1964-），男，副主任医师，硕士.

王辉，E-mail：lndlnsd@163.com

2014-01-20

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