Notch1在胰腺癌中的表达及临床病理学意义

朱雷，盛伟伟，董明，王科伟，于东洋

（中国医科大学附属第一医院普通外科教研室，胃肠外科，沈阳110001）

Notch1在胰腺癌中的表达及临床病理学意义

朱雷，盛伟伟，董明，王科伟，于东洋

（中国医科大学附属第一医院普通外科教研室，胃肠外科，沈阳110001）

目的探讨胰腺导管腺癌（PDAC）中Notch1蛋白和mRNA表达水平及临床病理学意义。方法应用免疫组织化学方法检测47对配对的PDAC及癌旁组织石蜡标本Notch1蛋白表达水平，观察其与PDAC患者临床病理学参数的关系；再以实时定量聚合酶链反应（QRT-PCR）检测3株不同分化程度的胰腺癌细胞系（PANC-1、BxPC-3和CANPAN-2）中mRNA表达。结果免疫组化结果显示：Notch1在癌组织中表达高于配对的癌旁组织（t=2.449，P=0.020）。Notch1的表达与肿瘤分化程度呈负相关（χ2= 7.144，P=0.028）。单因素及多因素分析发现Notch1是影响胰腺癌患者预后的一个独立因素（P值分别为0.014、0.026）。QRTPCR结果显示：mRNA水平随细胞分化程度增高而逐渐减弱。结论在PDAC中Notch1表达明显上调，并与肿瘤分化程度相关。Notch1可以作为评估PDAC患者预后的一个独立指标。

胰腺导管腺癌；Notch信号通路；Notch1

胰腺癌作为预后最差的恶性肿瘤之一，其恶性程度高、迅速播散和转移、放化疗耐受，从而造成预后不良，4年生存率一直低于4%，病死率占所有恶性肿瘤的第4位［1］。近年研究发现，包括Notch在内的多种信号通路在胰腺癌的发生和发展中起着重要作用［2，3］。Notch信号通路是一种普遍存在于从果蝇到哺乳动物等众多生命体中具有高度保守性的关键信号通路，根据其受体可分为Notch1、2、3、4。Notch1基因编码是Notch家族中的一员，通过调控细胞周期命运，在细胞发展进程中扮演了重要角色。Notch1作为Ⅰ型跨膜蛋白的一种，具有细胞表面受体和核转录调控的双重功能［4］，且Notch1受体也是最常被检测到的Notch受体家族成员，在肿瘤细胞的生长、增殖和凋亡过程中起着重要的调控作用［4］。在人类许多肿瘤中均检出Notch1受体表达量的异常（例如胶质瘤、甲状腺髓样癌、乳腺癌、肺癌、食管癌、子宫颈癌、原发性黑色素瘤和血液系统肿瘤等），高水平的Notch1受体及其配体往往被认为是恶性肿瘤的标识或预后不良的表现［6］。但在胰腺癌研究中鲜有针对Notch1的研究结果报道。本研究采用免疫组织化学和QRT-PCR方法，检测在不同分化程度的胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adeno-carcinoma，PDAC）中Notch1的表达水平，探讨其表达的临床病理学意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象及主要材料

收集2004年1月至2011年12月中国医科大学附属第一医院具有完整临床资料的PDAC手术切除标本（47例）及对应癌旁组织（对照组）。47例患者术后病理证实为原发性管状腺癌。胰腺癌细胞系，PANC-1（低分化）、BxPC-3（中分化）和CAPAN-2（高分化）均购自中科院上海细胞库，含10%胎牛血清1640培养液进行培养（HyClone，美国）。Notch1兔抗人单克隆抗体购自Abcam公司。SP法免疫组织化学试剂盒、DAB显色液购自福州迈新公司。RNA分离试剂盒Trizol、逆转录试剂盒（DRR037S）、SYBR GreenⅡ实时荧光定量PCR试剂盒等均购自日本TaKaRa公司。

1.2 免疫组织化学SP法检测

单纯退烧只是缓解发烧这一症状，不能治疗引起发烧的感染本身，也就是我们常说的“治标不治本”，要想彻底治愈疾病得针对造成感染的病原体本身。比如普通感冒，反复发烧3～4天很常见，吃退烧药就能退烧，几小时后体温又再次升高，这是正常现象。

总生存期是从手术日到患者因PDAC复发死亡之间的时间。死于其他疾病或在随访期内生存病例作为截尾事件处理。除去失访的4例，可用于生存分析随访病例为42例。Kaplan-Meier单因素生存分析显示Notch1低表达PDAC患者较高表达者预后好（P=0.014，图2）；单因素生存分析中所有参数均纳入多因素Cox回归分析，结果显示Notch1表达水平可以作为PDAC预后的独立的预测因素（P=0.026），相对危险系数为2.414（94%CI 1.294～4.014）。

Notch1在癌组织中表达高于配对的癌旁组织（t=2.449，P=0.020）；在PDAC中，Notch1有32例（46.1%）呈高表达；在癌旁组织中有16例（28.1%）呈高表达。Notch1蛋白主要表达于导管细胞，少量表达于胰岛细胞及胰腺正常腺泡细胞（图1A）；Notch1主要在胞质表达（图1A～1D）。

选取3株胰腺癌细胞系：CANPAN-2（高分化）；BxPC-3（中分化）；PANC-1（低分化）。采用RNA分离试剂盒Trizol提取并纯化细胞株总RNA，所有RNA样本浓度均稀释至1 μg/μL，根据TaKaRa逆转录和扩增试剂盒说明书进行逆转录和扩增。荧光实时PCR反应体系24 μL（TaKaRa 2×SYBRR Premix ExTaqTM12.4 μL，100 nmol/L上下游引物各1 μL，Cdna 2 μL，H2O 8.4 μL），反应条件：94℃4 min变性；94℃4 s，60℃30 s，40个循环，所有反应均设立复孔，并以DEPC水代替模板cDNA作为阴性对照。引物均由TaKaRa公司设计，上海生工合成。Notch1上游引物；4′-CGAGGTCAACACAGACGAGTG-3′，下游引物：4′-GCACAGATGCCCAGTGAAG-3′；GAPDH上游引物4′-CATGAGAAGTATGACAACAG CCT-3′；下游引物4′-AGTCCTFCCACGATACCAAA GT-3′。

1.4 结果判定

参考Sung等［7］的免疫组化评分方法：每张切片400倍显微镜下随机选取4个视野：（1）阳性细胞数：计算4个视野的阳性细胞的平均百分数，分为4级：阳性细胞数1%～24%为1分；24%～49%为2分；40%～74%为3分；≥74%为4分。（2）染色强度：无着色0分；浅黄色1分；黄或深黄色2分；棕或棕褐色3分，上述两项相乘为分级标准：≥4分定义为高表达。QRT-PCR分析结果得到细胞株标本中Notch1和GAPDH的阈值循环数（CT）值与其相对应的GAPDH的CT值相减，得到校正CT值。分别以CANPAN-2、BxPC-3、PANC-1细胞株为对照，与其余两种细胞株进行比较，比较公式：2-ΔΔCt=2-［（ΔCt目标细胞株目的基因-ΔCt内参基因）-（ΔCt对照细胞株目的基因-ΔCt内参基因）］。

采用SPSS 13.0统计软件。配对的癌与癌旁组织蛋白及3种不同PDAC细胞株mRNA表达评分后采用配对t检验。Notch1蛋白表达水平与患者临床病理学参数的关系采用χ2检验。Kaplan-Meier单因素分析计算累积生存率。Log-Rank进行生存时间差异检验；Cox多因素分析评估影响预后的独立因素。P＜0.04为差异有统计学意义。

通过χ2检验，Notch1蛋白表达与PDAC分化程度相关（χ2=7.144，P=0.028），见表1。随肿瘤分化程度降低Notch1表达逐渐增强（图1 B、1C、1D）。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 Notch1在PDAC和癌旁组织中表达

2.2 Notch1蛋白表达与PDAC患者临床病理学参数关系

1.3 QRT-PCR检测

在以往的语文学习中，学生的学习状态可以被称为“点状”的学习，缺乏系统性。而项目学习则凸显了整合学习的特征，即以尝试解决真实问题为项目主体，将语文学习和学生个人的体验相结合，从而帮助学生构筑独具特色的知识体系。教师在开展项目学习时，要根据学生的实际兴趣、学情等来确定项目学习的主题，然后分成几个小组，让学生通过自主合作探究的学习方式，完成项目任务。

酵母菌不服气道：“哼，你们人类一向以貌取人，但可别以‘小’取‘菌’。虽然我们是单细胞的生物，但我们是个大家族，已知的种类就有1 000多种。虽然我们个小，但是繁殖速度快，条件允许时，大概每两个小时就能繁殖一代。所以你们人类1 d，我们酵母菌都好几代同堂了，并且我们有好多好多的兄弟姐妹。我们也不像细菌那样，连个细胞核都没有，有真正的细胞核哟，可是真核生物。”

2.3 Notch1蛋白表达与胰腺癌患者术后生存关系

街道级交通指数的计算基于街道内每个路段的平均运行速度，来源于浮动车数据系统[4]. 区域平均TTI可由各路段的行驶里程(VMT)作权重对路段TTI进行加权求得，进一步把区域TTI折算成0～10的指数，计算公式如式(1)(2)：

所有组织标本均经4%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，以二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化。3%过氧化氢室温14 min去除内源性过氧化酶。磷酸盐缓冲液（PBS）清洗后，置于pH 6.0的枸橼酸缓冲液121℃高压热抗原修复4 min，自然冷却。血清室温封闭20 min后滴加一抗，4℃孵育过夜。次日依次滴加二抗及霉菌抗生物素蛋白。过氧化物酶37℃14 min，PBS清洗，DAB显色，苏木素复染，盐酸乙醇分化后常规脱水、透明，封片后于光学显微镜下观察结果。

表1 PDAC组织中Notch1的表达与临床病理学特征的关系Tab.1 The relationship between Notch1 expression in PDAC tissues and clinicopathological characteristics

图1 Notch1在正常胰腺及癌组织中的表达×200Fig.1 Expression of Notch1 in PDAC tissues and in pancreatic tissues×200

2.4 QRT-PCR结果分析

Notch1蛋白在不同分化程度的胰腺癌细胞系中mRNA表达随肿瘤分化程度降低而逐步增强，且与免疫组化分析结果趋势一致。即Notch1的mRNA在PANC-1的表达高于BxPC-3（t=2.943，P=0.010）；在BxPC-3的表达高于CANPAN-2（t=2.489，P= 0.023）。

图2 PDAC患者Notch1表达的KM生存曲线Fig.2 Kaplan-Meier survival curves of expression of Notch1 in patients with PDAC

3 讨论

一些研究发现Notch信号通路在消化系统恶性肿瘤的发生、进展及转移过程中均有作用，对于恶性肿瘤的生物学行为影响显著［8，9］。我们通过免疫组化检测发现，与癌旁正常组织比较，Notch1在PDAC中表达明显上调，且通过研究发现高表达Notch1的PDAC患者预后差，这就提示了Notch1的表达程度在PDAC的发生与发展过程中具有重要作用，可以作为评估PDAC患者预后的一个独立指标。

颈源性头痛在以往曾被称为“神经性头痛”、“神经血管性头痛”,“脑供血不足”“焦虑症、抑郁症”“肌紧张性头痛“枕大神经痛”,“耳神经痛”,“颈椎病”等。辗转就诊于“神经内科”、“精神科”,“疼痛科”、“中医针灸科”,“骨科”。以往认为此种头痛是头部的神经和血管在致病因素的作用下产生头痛,因而治疗方法主要是口服非甾体抗炎药物,头部针灸、理疗、按摩,头部痛点注射[1]。但有相当数量的患者的病情并不好转或疗效不持久。形成“病人头痛,医生也头痛”的局面。这一临床现状推动着对此类头痛发病机制的深入研究。由于此类患者大部分首先就诊于神经内科多见,故目前主张该病归属神经内科。

此外，Parr等［10］发现Numb的表达与乳腺癌的分化有关，正常组织中的Numb表达比乳腺癌中高，而Notch1几乎不表达。因此推测Notch1在乳腺癌中起癌基因的作用。还有研究表明，Numb通过影响胰腺癌的发生和发展［11］，而Numb对Notch的表达同样具有明确的抑制作用［12］，这都提示Notch1对于PDAC的生物行为存在着调控作用，进而影响恶性肿瘤的分化。我们的研究同样发现，在PDAC组织标本及胰腺癌细胞系中，随着肿瘤分化程度增高，Notch1蛋白的表达随之降低。

好在日前生态环境部发布了《关于生态环境领域进一步深化“放管服”改革，推动经济高质量发展的知道意见》。《意见》明确提出，各地要出台细化防止“一刀切”的有效措施，及时向社会发布公告。相关负责人也表示，按照《意见》要求，生态环境部将全面落实“双随机、一公开”制度，实现对不同生态环境水平监管对象的差别化管理，对超标企业加大查处力度，对长期稳定达标排放的合法企业减少监管频次。这对于环保达标的大中型企业算是好消息。但总的来说，短期内开工率稳中趋降。

然而，本实验没有通过体内或体外实验进一步验证Notch1对胰腺癌生物学功能的影响。但近年来一些研究发现，阻断Notch信号通路可以一定程度上抑制胰腺癌早期阶段上皮细胞的转化［13］，且对于Notch1信号通路的调控与结肠癌等消化系统肿瘤的化疗敏感性存在密切联系［14］。而特异性抑制肿瘤细胞Notch1活性药物能否应用于PDAC的临床治疗，目前尚未有研究证明，但通过现有的研究可以预见，随着研究的进一步深入，Notch1将很有可能成为未来PDAC临床治疗及判断预后的新指标。

［1］Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics，2009［J］.CA Cancer J Clin，2009，49（4）：224-249.

［2］Habbe N，Shi G，Meguid RA，et al.Spontaneous induction of murine pancreatic intraepithelial neoplasia（mPanIN）by acinar cell targeting of oncogenic Kras in adult mice［J］.Proc Natl Acad Sci U SA，2008，104（48）：18913-18918.

［3］Mullendore ME，Koorstra JB，Li YM，et al.Ligand-dependent Notch signaling is involved in tumor initiation and tumor maintenance in pancreatic cancer［J］.Clin Cancer Res，2009，14（7）：2291-2301.

［4］Rajith B，George Priya Doss C.Path to facilitate the prediction of functional amino acid substitutions in red blood cell disorders-a computational approach［J］.PLoS One，2011，6（9）：e24607.

［5］Garg P，Jeppsson S，Dalmasso G，et al.Notch1 regulates the effects of matrix metalloproteinase-9 on colitis-associated cancer in mice［J］.Gastroenterology，2011，141（4）：1381-1392.

［6］Reedijk M，Odorcic S，Chang L，et al.High-level coexpression of JAG1 and NOTCH1 is observed in human breast cancer and is associated with poor overall survival［J］.Cancer Res，2004，64（18）：8430-8437.

［7］Sung CO，Han SY，Kim SH.Low expression of claudin-4 is associated with poor prognosis in esophageal squamous cell carcinoma［J］. Ann Surg Oncol，2011，18（1）：273-281.

［8］Fre S，Huyghe M，Mourikis P，et al.Notch signals control the fate of immature progenitor cells in the intestine［J］.Nature，2004，434（7044）：964-968.

［9］van Es JH，van Gijn ME，Riccio O，et al.Notch/gamma-secretase inhibition turns proliferative cells in intestinal crypts and adenomas into goblet cells［J］.Nature，2004，434（7044）：949-963.

［10］Parr C，Watkins G，Jiang WG.The possible correlation of Notch-1 and Notch-2 with clinical outcome and tumour clinicopathological parameters in human breast cancer［J］.Int J Mol Med，2004，14（4）：779-786.

［11］Sheng W，Dong M，Zhou J，et al.Cooperation among Numb，MDM2 and p43 in the development and progression of pancreatic cancer［J］.Cell Tissue Res，2013，344（2）：421-432.

［12］Couturier L，Mazouni K，Schweisguth F.Inhibition of Notch recycling by Numb：relevance and mechanism（s）［J］.Cell Cycle，2013，12（11）：1647-1648.

［13］De La OP，Emerson LL，Goodman JL，et al.Notch and Kras reprogram pancreatic acinar cells to ductal intraepithelial neoplasia［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2008，104（48）：18907-18912.

［14］Meng RD，Shelton CC，Li YM，et al.gamma-secretase inhibitors abrogate oxaliplatin-induced activation of the Notch-1 signaling pathway in colon cancer cells resulting in enhanced chemosensitivity［J］.Cancer Res，2009，69（2）：473-482.

（编辑 武玉欣）

ClinicopathologicalSignificance ofthe Expression ofNotch1 in Human Pancreatic Cancer

ZHULei，SHENGWei-wei，DONGMing，WANGKe-wei，YU Dong-yang
（UnitofGastrointestinalSurgery，DepartmentofGeneralSurgery，The FirstHospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo explore the clinicopathologicalsignificance ofthe expression ofnotch1 protein and mRNA levelsin pancreatic ductaladenocarcinoma（PDAC）.MethodsThe expression of notch1 protein in 47 pairs of paraffinembedded PDAC specimens and adjacent non-cancerous pancreatic tissues were detected by immunohistochemistry.The relationship between the protein expression and clinicopathological characters was analyzed.Quantitative real-time polymerase chain reaction（QRT-PGR）were used to examine the mRNA expression ofnotch1 in 3 differentdifferentiated pancreatic cancercells（PANC-1，BxPC-3＆CAPAN-2）.ResultsThe expression ofNotch1 protein was higherin PDAC compared with that in paired non-cancerous pancreatic tissues（t=2.449，P=0.020）.The expression of notch1 protein had a negative correlation with tumor differentiation（χ2=7.144，P=0.028）.Univariate and multivariate analysis with clinicopathological characters revealed that the notch1 expression was an independent prognostic indicator for PDAC patients（P1=0.014；P2=0.026）.Moreover，the mRNA expression of notch1 was gradually reduced with the increase ofdifferentiation degree ofpancreatic cancercellshowed by QRT-PCR results.ConclusionNotch1 is up-regulated in PDAC.Itis correlated with tumordifferentiation.Notch1 expression isan independentprognostic indicatorfor PDAC patients.

pancreatic ductal adenocarcinoma；Notch signal pathway；Notch1

R734.9

A

0248-4646（2014）04-0320-04

辽宁省科学事业公益研究基金（2013001008）；辽宁省教育厅特聘教授专项基金［辽财指教（2012）412］

朱雷（1984-），男，助教，硕士.

董明，E-mail：cmudongming@sohu.com

2014-01-24

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