前列腺癌PTEN蛋白与雄激素受体的表达

2014-03-21孙健玮王剑松刘子超杨峻峰马辉郑立民

中国医科大学学报 2014年4期

孙健玮，王剑松，刘子超，杨峻峰，马辉，郑立民

（1.昆明医科大学第二附属医院泌尿外科，昆明650101；2.昆明学院生命科学与技术系，昆明650214；3.昆明医科大学第五附属医院泌尿外科，云南个旧661000）

前列腺癌PTEN蛋白与雄激素受体的表达

孙健玮1，王剑松1，刘子超2，杨峻峰1，马辉1，郑立民3

目的探讨前列腺癌组织中张力蛋白同源第10号染色体缺失的磷酸酶基因（PTEN）蛋白与雄激素受体（AR）的表达及其与临床分期的关系。方法用RT-PCR方法分析30例前列腺增生症和41例前列腺癌穿刺取材组织的PTEN和AR表达，经Western blot方法验证，分析其与临床分期的关系。结果与前列腺增生症比较，前列腺癌组织中PTEN表达显著降低（P＜0.01），且与临床分期呈负相关（r=-0.972，P＜0.01）；AR的表达在前列腺癌早期高于前列腺增生症（P＜0.04），随肿瘤临床分期的增高呈显著降低（P＜0.01）。在前列腺癌临床分期增高的进程中，PTEN与AR表达存在相关性（r=0.886，P＜0.04）。结论随前列腺癌临床分期的增高，PTEN蛋白与AR表达呈显著减低，二者表达具有相关性。

张力蛋白同源第10号染色体缺失的磷酸酶基因；雄激素受体；前列腺癌

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是老年男性常见的恶性肿瘤之一。据统计，美国2012年前列腺癌新增病例占同期男性全部新增癌症患者总数的28.4%，位居癌症新发病率的首位，前列腺癌的诊治及其发病机制的研究日益受到关注［1］。张力蛋白同源第10号染色体缺失的磷酸酶基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）属于抑癌基因，其表达水平降低或丢失与多种肿瘤的发生密切相关［2，3］。研究表明前列腺癌患者基因突变率或杂合缺失率显著高于正常人［4，4］。雄激素受体（androgen receptor，AR）是雄激素代谢和作用的重要环节，具有调控前列腺上皮细胞生长、增殖、分泌等功能，在前列腺癌发生发展过程中其影响作用显著［6］。AR的表达与PTEN是否存在相关性的研究少有报道。本研究通过比较PCa与前列腺增生症（benign prostate hyperplasia，BPH）组织中PTEN和AR的表达差异及其相关性，以期探索PTEN与AR之间的关系，为前列腺癌发病机制研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本：收集前列腺癌组织标本41例，并选取30例BPH组织标本作为对照（对照组）。所有组织标本为2012年10月至2013年9月昆明医科大学第二附属医院和第三附属医院超声引导前列腺穿刺取材获得，经病理诊断证实。前列腺癌患者年龄61～82岁，中位数年龄69岁，所有研究对象未接受任何治疗。标本收集均经患者及医院伦理委员会同意。

1.1.2 临床分期：根据AJCC和UICC推荐的TNM分期标准［7］，将41例前列腺癌分为：Ⅰ期（T1a-cN0M0，T1-2aN0M0）1例，Ⅱ期（ⅡA：T1a-cN0M0，T2abN0M0；ⅡB：T2c N0M0，T1-2 N0M0）17例，Ⅲ期（T3ab N0M0）4例，Ⅳ期（T4 N0M0，T任何N1M0，T任何N0M1）19例。

1.1.3 试剂：组织总RNA提取试剂盒、cDNA一链合成试剂盒和R-T PCR试剂盒均购自大连TakaRa公司。引物由北京三博远志生物科技有限公司合成。兔抗PTEN、山羊抗AR和兔抗β-actin抗体购自Santa cruz公司，小鼠抗兔和小鼠抗山羊IgG购自美国KPL公司。

1.2 方法

1.2.1 组织取材方法：41例PCa入组活检取材的指征为直肠指诊阳性；前列腺超声或CT检查提示低回声结节或异常信号；PSA＞4 ng/mL。术前1 h清洁灌肠；术前术后各口服3 d抗生素：灭滴灵0.4 g，3次/d，氟哌酸0.2 g，2次/d。HITACHI EUB-7400彩色超声诊断仪，V43W腔内探头使用频率7～14 MHz；美国BARD自动活检枪，活检射程24 cm，18 G×24 cm穿刺针，取材长度14～19 cm。患者取侧卧位，会阴部及直肠消毒后采用系统10点穿刺法［8］，在标准系统6点（前列腺旁正中线矢状切面尖部、中部、底部）基础上，两外侧各增加2针（外侧周缘中部、底部），同时对超声所见可疑回声区随机增加穿刺点。30例BPH入组患者为活检穿刺后病理诊断前列腺增生症并排除PCa的患者。穿刺取材组织离体后1份立即存入液氮作相关检测，1份经10%甲醛固定后送病理检验。

1.2.2 RT-PCR检测：用组织总RNA提取试剂盒提取样品总RNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性，分光光度计测定RNA的浓度。cDNA一链合成试剂盒将RNA逆转录为cDNA，并Real Time PCR-SYBR Green试剂盒进行RT-PCR反应。反应条件为：首先94℃3 min变性，然后进行40个PCR循环，循环条件为：94℃30 s变性，44℃20 s退火，72℃20 s延伸。PTEN序列引物为：上游4′-CTTGACCAATGGC TAAGTGAAGATG-3′，下游4′-GCACATATCATTAC ACCAGTTCGTCC-3′。AR序列引物为：上游4′-AGAAGACCTGCCTGATCTGTGGAGA-3′，下游4′-TCTTTTGAAGAAGACCTTGCAGCTTC-3′。内参β-ACTIN的序列引物为：上游4′-CAAGGCCAACCGCG AGAAGA-3′，下游4′-GGGATAGCACAGCCTGGAT AGCA-3′。反应体系为20 μL，用Bio-Rad公司IQ4荧光实时定量PCR仪进行反应。

1.2.3 Western blot检测：组织经裂解液裂解并离心提取蛋白质，Bio-rad蛋白定量试剂盒测定总蛋白浓度。等量的总蛋白经煮沸变性后进行SDS-PAGE凝胶电泳，湿法转膜，4%奶粉溶液封闭2 h，一抗（兔抗PTEN，山羊抗AR和兔抗β-actin抗体）孵育过夜，二抗（小鼠抗兔和小鼠抗山羊IgG）孵育4 h，滴加适量ECL化学发光底物，显影。实验重复3次。

1.3 统计学处理

SPSS 16.0统计软件分析，组间数据比较采用方差分析，PTEN和AR在不同临床分期之间的表达相关性用Spearman等级相关性分析，P＜0.04为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 前列腺癌PTEN的表达

将PCa临床Ⅰ期和Ⅱ期患者合并为1组（共18例），Ⅲ期和Ⅳ期患者合并为1组（共23例），与对照组比较，PCa（Ⅰ+Ⅱ）组和（Ⅲ+Ⅳ）组的PTEN表达均显著降低（P＜0.01）。随着临床分期的增加，PTEN表达量呈减少趋势（P＜0.01）。见表1，图1。

2.2 前列腺癌AR的表达

与对照组比较，在PCa（Ⅰ+Ⅱ）组的AR表达显著增加（P＜0.04），而在（Ⅲ+Ⅳ）组AR表达显著降低（P＜0.01）。见表1，图1。

表1 各组PTEN及AR相对表达的比较Tab.1 The expression of PTEN and AR in different group

1）P＜0.01，2）P＜0.04 vs control；3）P＜0.01 vs groupⅠ+Ⅱ.

图1 不同临床分期前列腺癌PTEN和AR的表达Fig.1 The expression of PTEN and AR in different PCa’s clinical stage

2.3 相关性分析

Spearman等级相关性分析表明，PTEN的表达与前列腺癌临床分期存在负相关（r=-0.972，P＜0.01）。随前列腺癌临床分期的增高，PTEN与AR表达存在相关性（r=0.886，P＜0.04）。

3 讨论

前列腺癌常见于老年男性，其诱因包括遗传、饮食、药物、病源微生物等多种因素。抑癌基因缺失在前列腺癌早期发生过程中起着十分重要的作用。PTEN是继p43后克隆到的肿瘤抑制基因之一，该基因突变或表达缺失与多种肿瘤发生相关［9，10］。PTEN具有磷酸化酶活性，能通过多种途径抑制肿瘤发生，如抑制PI3K/AKT信号通路、使FAK去磷酸化以及抑制MAPK信号通路等［11～14］。PTEN在前列腺癌发生发展过程中所发挥的抑制细胞生长、促进凋亡、调控细胞周期、抑制细胞黏附和转移等作用也日益受到关注［14］。本研究结果表明PTEN表达与PCa的发生有关：PCa组织中PTEN表达显著低于BPH，而且随着PCa临床分期的增高，PTEN表达呈降低的趋势，提示PTEN对PCa的发生发展具有抑制作用。Grasso等［16］研究表明PTEN基因的改变是PCa发生的早期事件，PTEN基因缺失或者表达降低引起一系列相关基因表达模式改变，最终引起细胞增殖失控产生癌变。

AR是雄激素的主要分子靶标，存在于成人前列腺间质细胞和腺上皮细胞的细胞核内。AR通过直接与DNA序列结合，调节相关基因的表达，在男性生殖器官形成、第二性征发育、蛋白质合成代谢、骨骼和肌肉的发育等多方面发挥重要的功能［17，18］。研究结果表明PCa的发生与AR表达改变相关，AR过量表达能促进前列腺细胞增殖，并最终导致早期PCa的发生［19］。大多数PCa病程的早期呈现对雄激素的依赖而激素阻断治疗有效，经历18～24个月后这种激素阻断治疗效果极为有限［20］，表现为肿瘤对雄激素的非依赖性（即激素非依赖性前列腺癌）。尽管目前关于前列腺癌组织中AR表达情况的研究结果不一，但AR在前列腺癌的激素依赖向激素非依赖的转化过程中具有重要作用是具有共识的［21］。本研究结果显示：在PCa发生早期，AR的表达较BPH组织中的表达显著增加，但随着肿瘤临床分期的增高，AR的表达呈递减趋势，甚至低于BPH。该结果与国内部分研究报道一致［22，23］。

PCa的发生机制十分复杂，转录组学和基因组学研究表明，PTEN基因缺失和AR过表达都能引起前列腺癌的发生和发展［16］。本研究结果表明，PTEN与AR表达存在相关性，而AR的表达受多种机制的调控，PTEN可能是影响AR表达的因素之一。PCa组织中PTEN和AR随肿瘤临床分期增高而表达减低的趋势，可作为PCa诊断和疗效判断的参考指标。

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（编辑武玉欣）

The Expression of PTENProtein and Androgen Receptor in Prostate Cancer

SUNJian-wei1，WANGJian-song1，LIUZi-chao2，YANG Jun-feng1，MAHui1，ZHENGLi-min3
（1.Department of Urology，the Second Affiliated Hospital，Kunming Medical University，Kunming 640101，China；2.Department of Biologican Science and Technology，Kunming University，Kunming 640214，China；3.DepartmentofUrology，the Fifth Affiliated Hospital，Kunming MedicalUniversity，Gejiu 661000，China）

ObjectiveTo study the expression of PTEN protein and androgen receptor（AR）in prostate cancer and their relationship with clinical stage.MethodsThe expression of PTEN and androgen receptor were detected by RT-PCR and Western blot in 30 benign prostate hyperplasia（BPH）and 41 prostate cancer（PCa）samples.The relativity was analyzed on the basis of clinical stage.ResultsCompare to BPH，the expression of PTEN was significantly lower in PCa（P＜0.01）.The expression of PTEN was negatively related to clinical stage（r=-0.972，P＜0.01），and the expression ofAR in early PCa was higherthan BPH（P＜0.04），butitappears significantdecrease in the advanced clinicalstage（P＜0.01）.The expression ofPTENcorrelated with ARexpression in the advanced clinicalstage（r=0.886，P＜0.04）.ConclusionThe expression ofPTENand AR in PCa was lowersignificantly than in BPH in the advanced clinicalstage，there was relativity between the expression ofPTENand AR.

phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten；androgen receptor；prostate cancer

R737.24

0248-4646（2014）03-0316-04

云南省应用基础研究资助项目（2013FZ282）

孙健玮（1968-），男，主任医师，博士研究生.

王剑松，E-mail：Jiansongwang@yahoo.com

2013-12-30

网络出版时间：