原子力显微镜研究DPPC磷脂多层膜结构与力学性能

赵新军，张国梁

（1.伊犁师范学院新疆凝聚态相变与微结构实验室，伊宁835000；2.伊犁师范学院电子与信息工程学院，伊宁835000）

1 引 言

细胞膜的许多性质，都是通过磷脂双层膜表现出来.因此，磷脂双层膜作为细胞膜的可靠简化模型已被广泛地加以研究.人们应用X 射线衍射、中子散射、核磁共振、荧光光谱分析、原子力显微镜（atomic force microscope，AFM）等揭示了磷脂双层膜的结构特性和相行为.计算机模拟证实了在生理温度和水化条件下，磷脂双层膜呈现流体液晶（Lα）相行为.在实验研究方面，原子力显微镜对磷脂双层膜的研究是一个非常新颖而且十分有效的工具.应用原子力显微镜不仅可以获得膜表面高分辨率的形貌、微区特征，而且还可以在分子水平上测量膜表面和原子力显微镜探针间的作用力.文献［1-4］应用原子力显微镜研究了磷脂双层膜的形貌特性、相分离及力学性能.孙润广等［5-7］开展了在原子力显微镜探针作用下磷脂双层膜稳定性的实验研究.然而，大量的研究只限于吸附在衬底上磷脂双层膜，衬底效应会影响原子力显微镜探针对磷脂双层膜的穿透行为［8］，从而不能获得磷脂双层膜理想的力学性能.由多层磷脂双层膜重叠堆积形成的磷脂多层膜可以避开衬底效应，多层膜中的磷脂双层可达几百到几千层［9］，原子力显微镜探针可以穿透多层而不会接触到衬底，也就排除了衬底效应.另外，多层膜作为一种新材料在药物的输运、防腐涂层、燃料电池及生物医学移植等领域有着广泛的应用前景.研究发现，多层薄膜材料的一些奇异特性和多层膜的结构特性、力学性能是直接相关的［9-11］.应用X 射线衍射和中子散射可以探测多层膜的结构特性，文献［12］应用X 射线衍射方法研究了在Na+、Mg2+、Zn2+、和Ca2+溶液中多层磷脂膜的结构特性，文献［13］应用X 射线衍射和差示扫描量热法研究了胆固醇对二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）多层膜中双分子层厚度、相变的影响.应用X 射线衍射和中子散射虽然可以探测多层膜的结构特性，但是却很难定量研究多层膜的力学性能.应用原子力显微镜，通过测量探针和磷脂分子间的作用力并结合Hertz模型，不但可以定量地确定多层膜的结构特性，还可以给出多层膜弹性模量和弯曲度.在本文中，我们应用原子力显微镜进一步研究DPPC 双层磷脂膜在蔗糖溶液中的结构特性和杨氏模量，制备DPPC 多层磷脂膜，研究DPPC多层磷脂膜在纯水中、CaCl2溶液中的结构特性和杨氏模量.

2 材料和方法

2.1 实验材料

纯度为99%的DPPC 为Avanti Polar Lipids（Alabaster，AL）公司产品，氯仿、甲醇为北京化工厂产品（分析纯）.

2.2 制备DPPC 双层、多层膜

DPPC被溶解在氯仿和甲醇的混合液（3∶1）中，配制浓度为2mM 的DPPC溶液.提取500μL DPPC 溶液注入到玻璃小瓶中并用氮气吹干，然后放入真空中保存24小时去除残余的有机溶剂.加入去离子纯净水稀释，获得浓度为500μM 的DPPC溶液，将溶液进行30秒的恒温转动震荡，使得溶液混合均匀，超声20 min形成单层囊泡，取50 μL相应的囊泡溶液覆盖在干净的云母片上沉积并用去离子水冲洗形成双层膜，多次沉积并用去离子水冲洗则形成多层膜.

2.3 AFM 测量

应用Nanowizard II Bio AFM（JPK Instruments，Berlin，Germany）配置Olympus1×71 荧光显微镜，悬臂弹性常数在0.15～0.28N／m 范围内的DNP-S探针在室温下测量成像.形貌图成像和力曲线的测量均采用接触模式（Contact mode），力曲线测量加载率（loading rate）为0.5μm／s，探针弹性常数可以通过热噪声方法确定.

3 实验结果与讨论

3.1 AFM 研究在蔗糖溶液中的DPPC 双层膜

蔗糖作为一种多羟基化合物有利于提高膜的稳定性，因此在蔗糖溶液中能够形成较为完整的双层膜（图1）.在蔗糖溶液（40mM）中观测DPPC磷脂双层膜的表面形貌图如图1所示，从形貌图中可以看出，在双层膜形成的过程中出现了高低层状结构，最大高度差约为6nm.对作用力测量可以获得排斥力和AFM 针尖与样品距离的力曲线.如图2所示，AFM 针尖在逐渐靠近样品的过程中排斥力由零开始逐渐变大，排斥力开始不为零的点可以认为是针尖和样品的接触点（A 点），当针尖接触样品后排斥力开始增加，同时膜表面也受到了针尖的压力，并开始发生形变.随着针尖的靠近，针尖对膜的压力变得越来越大（A 到B 过程），当压力达到一定数值，膜的表面对针尖的承受力达到了最大（B点），针尖再靠近就会穿透膜，在力曲线上会出现排斥力的突然下降（C 点）.针尖从A 到C 走过的距离即为穿透膜的厚度，在针尖穿透时膜承受的最大力 定 义 为 穿 透 力（Breakthrough force）［1］.穿透力与膜的力学性能紧密相关，平均穿透力越大，膜的力学性能越稳定［4］.

对形貌图1中标记的部分进行力谱测量可以得到在蔗糖溶液中双层膜的力曲线图（图3），从图中可以看出在AFM 针尖与样品距离为-30nm处，力曲线出现了突然下降的拐点，这意味着针尖穿过双层膜，穿透力（Breakthrough force）约为6.5 nN，针尖从接触到膜被穿透的距离即为穿透膜的厚度，对多个力曲线统计可以获得针尖穿越的双层膜的厚度为5.7135～6.2863nm 这与形貌图中观测膜厚度数据一致，并且与文献［12］测定的DPPC双层厚度结果一致，这说明可以通过力曲线分析膜的结构特性.

图1 在蔗糖溶液中观测DPPC 磷脂双层膜的表面形貌图Fig.1 AFM height image of DPPC bilayer in sugar solution

图2 针尖与样品之间距离与排斥力曲线图A：针尖和样品接触点，B：穿透力，C：探针穿透膜Fig.2 Force curves indicating quantities extracted：breakthrough force and indentation region.Points of interest：A，contact point；B，onset of breakthrough；C，onset of substrate

图3 形貌图1中标记的部分的力曲线Fig.3 Typical force curve of the area showing in Fig.1

图4 计算杨氏模量的力曲线上的取值范围和参数Fig.4 The range and parameters necessary for data analysis are depicted in the force curve graph

图5 在蔗糖溶液中DPPC双层膜的杨氏模量Fig.5 The Young's modulus of the DPPC bilayer in sugar solution

取力曲线图4所示的范围和参数，由Hertz模型和胡克定律可以得到杨氏模量为［14］

其中k为探针悬臂弹性常数，Y 为杨氏模量，ν为泊松分布，α为针尖的半开角.对多个力曲线统计杨氏模量（图5）可以获得在蔗糖溶液中双层膜的杨氏模量为：Y =11.962±3.64841KPa.

3.2 AFM 研究在纯水中的DPPC 多层膜

在纯水中，磷脂多层膜是由磷脂双层和双层之间夹着的水层重叠堆积构成，具有交替多层结构，磷脂双层之间存在范德瓦尔斯吸引力［12］.多层膜的厚度是多层水层厚度与多个双层厚度的总和（图6）.应用AFM 可以获得DPPC 多层膜在纯水中的形貌图（图7）.

图6 DPPC多层膜结构图Fig.6 Illustration of DPPC multilayer

图7 在纯水中多层膜形貌图Fig.7 AFM height images of DPPC multilayer in pure water

从以上形貌图中可以看出，在多层膜形成的过程中出现了高低层状结构，最大高度差约为14 nm，明显大于双层DPPC 膜的厚度［12］，因此，我们制备的多层膜具有磷脂双层和水层构成的交替多层结构.

图8 形貌图7中标记部分的力曲线图Fig.8 Typical force curve of the area showing in Fig.7

图9 在纯水中DPPC多层膜的杨氏模量Fig.9 The Young's modulus of the DPPC multilayer in pure water

对形貌图7中标记部分进行力谱测量可以得到力曲线图（图8），从放大的插入图中可以看出在AFM 针尖与样品距离为-304.5256 nm 和-314.38282nm 处，力曲线出现了突然下降的拐点，这意味着有两次穿膜.针尖在距离样品-304.5256nm 处穿透力（Breakthrough force）为19.22014nN，比较在蔗糖溶液中针尖穿过双层膜穿透力6.5nN 可以发现，针尖穿越多层膜的厚度远大于双层膜的厚度，但是穿透力仅仅约为双层膜穿透力的3倍，一方面这是由于蔗糖有利于提高膜的稳定性，另一方面是由于双层膜直接沉积在云母片上，存在衬底效应，但是对于多层膜，针尖不会接触到衬底，因此不存在衬底效应.由此可见，衬底在很大程度上影响膜的稳定性.从力曲线图中可以分析膜第一次被穿透的距离即为第一次穿透膜的厚度，对多个力曲线统计可以获得针尖第一次穿越的多层膜的厚度为108.16364±5.28683nm.

由n表示穿透的层数，D 表示磷脂双层膜的厚度，d 表示水层的厚度，H 表示针尖穿过多层膜的厚度，可以得到关系式：

nD+（n-1）d=H （2）

由上式及双层DPPC膜的厚度和n 取整数可以拟合计算出水层的平均厚度为2.74123±0.13419 nm 与文献［12］测量的水层厚度在2～3nm 结果一致，并可以估算出穿越的层数约为12层.

对形貌图7中标记部分的多个力曲线统计计算杨氏模量（图9），可得第一次穿过的多层膜的杨氏模量：Y =1.10004±0.24517 MPa

3.3 AFM 研究在CaCl2 溶液中的DPPC多层膜

在CaCl2溶液（50mM）中观测DPPC 磷脂多层膜的表面形貌图如图10所示.

图10 在CaCl2 溶液中观测DPPC多层膜的表面形貌图Fig.10 AFM height images of DPPC multilayer in CaCl2solution

从以上形貌图中可以看出，在CaCl2溶液中多层膜形成的过程中出现了高低层状结构，最大高度差约为54nm，聚集部分厚度甚至达到200 多纳米.因此具有多层结构.对形貌图中标记部分进行力谱测量可以获得力曲线（图11）.

图11 形貌图10中标记的部分的力曲线图Fig.11 Typical force curve of the area showing in Fig.10

图12 在CaCl2 溶液中DPPC多层膜的杨氏模量Fig.12 The Young's modulus of the DPPC multilayer in CaCl2solution

从放大的插入图中可以看出，AFM 针尖在逐渐靠近样品的过程中力曲线出现了三次跳跃，对应着三次穿膜过程，根据力曲线，针尖第一次穿越的多层膜的厚度为82.15251±4.35633nm，拟合计算出水层的平均厚度为4.85199±1.3738nm，穿越的层数约为8层.在CaCl2溶液中多层膜中水层厚度大于在纯水中厚度，这是由于Ca离子可以被吸附到兼性DPPC磷脂分子的头部，DPPC 磷脂分子头部带电后增强了磷脂双层间的排斥力，使得双层之间距离增加，中间水层变厚［12］.对穿过的多层统计计算杨氏模量可得：Y =260.825±82.5993 KPa.该杨氏模量远小于在纯水中的杨氏模量，一方面这是由于针尖穿越的层数不同，更重要的是盐的加入会降低膜的弹性模量［15］.

4 结 语

磷脂多层膜作为纳米和微米载药体系和有机光电复合材料有着广泛的应用前景，本文应用原子力显微镜，首先通过对形貌图和力曲线的测量，获得了在蔗糖溶液中的磷脂双层膜的厚度，这与文献［12］测定的结果近似一致.通过对力曲线分析，计算了双层膜的杨氏模量，这对于膜力学性能的研究将有一定意义.其次，应用原子力显微镜测量了多层膜形貌图和力曲线，研究了在纯水中、CaCl2溶液中的多层膜的结构特性，通过分析力曲线我们计算了多层膜的杨氏模量.研究发现：在CaCl2溶液中DPPC多层膜的水层厚度大于在纯水中厚度；衬底在很大程度上影响膜的稳定性；在CaCl2溶液中DPPC多层膜的杨氏模量会变小.

目前，多层膜材料作为一种具有高反射性和良好稳定性的多层膜元件，已在天文学、显微学、材料科学、同步辐射和等离子体诊断等领域内获得了广泛应用，在多层膜研究方面已经取得了新的进展［16-19］.相比单层膜，多层膜具有不可比拟的优越性，我们避开衬底效应，应用原子力显微镜研究了DPPC多层膜结构与力学性能，希望能对探索膜的结构和功能及多层膜材料的设计提供参考.

［1］ Li J K，Sullan R M A，Zou S.Atomic force microscopy force mapping in the study of supported lipid bilayers［J］.Langmuir，2011，27：1308.

［2］ Sullan R M A，Li J K，Hao C C，et al.Cholesteroldependent nanomechanical stability of phase-segregated multicomponent lipid bilayers［J］.Biophysical Journal，2010，99：507.

［3］ Garcia-Manyes S，Redondo-Morata L，Oncins G，et al.Nanomechanics of lipid bilayers：heads or tails？［J］.J.Am.Cem.Soc.，2010，132：12874.

［4］ Goertz M P，Stottrup B L，Houston J E，et al.Nanomechanical contrasts of gel and fluid phase supported lipid bilayers［J］.J.Phys.Chem.B，2009，113：9335.

［5］ Sun R G，Zhang J，Qi H，et al.Effects of cholesterol on the lipid bilayer structure by SAXS and STM［J］.Acta Biophysica Sin.，2001，17 （1）：53（in Chinese）［孙润广，张静，齐浩，等.胆固醇对脂双层结构影响的SAXS 和STM 研究［J］.生物物理学报，2001，17（1）：53］

［6］ Sun R G，Qi H，Zhang J.Structures and properties of liposome by atomic force microscope［J］.Acta Phys.Sin.，2002，51（6）：1203（in Chinese）［孙 润广，齐浩，张静.脂质体结构特性的原子力显微镜研究［J］.物理学报，2002，51（6）：1203］

［7］ Sun R G，Zhang J.Observation of the structure morphology and stability of lipid vesicles by atomic force microscope［J］.J.At.Mol.Phys.，2003，20（1）：85（in Chinese）［孙润广，张静.原子力显微镜观察脂胞囊形貌结构及稳定性［J］.原子与分子物理学报，2003，20（1）：85］

［8］ Almquist B D，Melosh N A.Fusion of biomimetic stealth probes into lipid bilayer cores［J］.PNAS.，2010，107（13）：5815.

［9］ Mermut O，Lefebvre J，Gray D G，et al.Structural and mechanical properties of polyelectrolyte multilayer films studied by AFM ［J］.Macromolecules，2003，36：8819.

［10］ McAloney R A，Sinyor M，Dudnik V，et al.Atomic force microscopy studies of salt effects on polyelectrolyte multilayer film morphology［J］.Langmuir，2001，17：6655.

［11］ Franz V，Loi S，Muller H，et al.Tip penetration through lipid bilayers in atomic force microscopy［J］.Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2002，23：191.

［12］ Szekely O，Steiner A，Szekely P，et al.The structure of ions and zwitterionic lipids regulates the charge of dipolar membranes［J］.Langmuir，2011，27：7419.

［13］ Xu Y M.The effects of cholesterol on the structure of DPPC multilayers［J］.Acta Biophysica Sin.，2001，17（1）：53（in Chinese）［徐育敏.胆固醇对二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）多层膜结构的影响［J］.生物物理学报，2001，17（1）：53］

［14］ Domke J，Radmacher M.Measuring the elastic properties of thin polymer films with the atomic force microscope［J］.Langmuir，1998，14：3320.

［15］ Blacklock J，Vetter A，Lankenau A，et al.Tuning the mechanical properties of bioreducible multilayer films for improved cell adhesion and transfection activity［J］.Biomaterials，2010，31（27）：7167.

［16］ Yan M L，Li S X.A new characteristics of metal magnetic multilayer films：giant magnetoresistance effects［J］.Physics，1994，23（6）：335（in Chinese）［阎明朗，李淑祥.金属磁性多层膜的新颖特性──巨磁电阻效应［J］.物理，1994，23（6）：335］

［17］ Jiang H W.Giant magnetoresistance effects of magnetic metallic multilayers［J］.Physics，1997，09（26）：562（in Chinese）［姜宏伟.磁性金属多层膜中的巨磁电阻效应［J］.物理，1997，09（26）：562］

［18］ Yuan B，Xing L L，Zhang Y D，et al.Self-assem-bly of highly oriented lamellar nanoparticle-phospholipid nanocomposites on solid surfaces［J］.J.Am.Cem.Soc.，2007，129：11332.

［19］ Lu Y，Hu S X，Mai Z H，et al.Structure of solidsupported short chain DNA／lipid multilayers［J］.Nuclear Techniques，2009，32（12）：897（in Chinese）［陆颖，胡书新，麦振洪，等.同步辐射X 射线衍射研究短链DNA／磷脂多层膜的结构［J］.核技术，2009，32（12）：897］

［20］ Lisunova M O，Drachuk I，Shchepelina O A，et al.Direct probing of micromechanical properties of hydrogen-bonded layer-by-layer microcapsule shells with different chemical compositions［J］.Langmuir，2011，27：11157.

［21］ Mu Y C，Qiu T，Li X C，et al.Layer-by-layer synthesis of multilayer core shell latex and the film formation properties［J］.Langmuir，2011，27：4968.

［22］ Sovago M，Wurpel G W，Smits M，et al.Calciuminduced phospholipid ordering depends on surface pressure［J］.J.Am.Cem.Soc.，2007，129：11082.

［23］ Simonsen A C，Bagatolli L A.Structure of spincoated lipid films and domain formation in supported membranes formed by hydration［J］.Langmuir，2004，20：9720.

［24］ Mennicke U，Salditt T.Preparation of solid-supported lipid bilayers by spin-coating ［J］.Langmuir，2002，18：8172.

［25］ Schäfer A，Salditt T，Rheinstädter M C.Atomic force microscopy study of thick lamellar stacks of phospholipid bilayers［J］.Phys.Rev.E，2008，77：0219051.

［26］ Jiang Z Y，Zhang G L，Ma J，et al.Lipid exhange between membranes：effects of temperature and ionic strength［J］.Acta Phys.Sin.，2013，62（1）：18701（in Chinese）［蒋中英，张国梁，马晶，等.磷脂在膜结构间的交换：温度和离子强度的影响［J］.物理学报，2013，62（1）：18701］