纳米金光度法测定维生素B1

王瑞勇， 范淑敏， 康小慧， 王 瑞， 葛宝玉， 贾雪雷

(郑州大学化学与分子工程学院 河南郑州450001)

0 引言

纳米金以其独特的物理和化学性质成为研究热点［1－3］，近年来主要用作光学探针及电化学传感器．纳米金具有很好的生物相容性，能够和生物分子发生相互作用产生聚集，吸收峰红移至600～700 nm之间，溶液的颜色由原来的酒红色变为紫色或蓝色．纳米金比色法已用于多种物质的检测，包括DNA、蛋白质、农药和金属离子等［4－9］，在生物分析、环境检测等方面具有很大的应用前景．

维生素B1能够构成辅酶维持体内的正常生理代谢，在临床上主要用于防治脚气病，辅助治疗神经炎、消化不良、全身感染、高热、糖尿病、甲状腺功能亢进等各种疾病．目前国内外报导的测定维生素B1的方法主要有高效液相色谱法［10］、光度法［11］、荧光法［12］、化学发光法［13］、电化学法［14－15］等，还没有用纳米金作探针应用于分子光谱法测定维生素B1的报道，本实验用纳米金测定维生素B1，灵敏度较高，而且操作简单，拓宽了纳米金在药物分析中的应用．

1 实验部分

1．1 实验药品与仪器

氯金酸(阿拉丁试剂有限公司)，维生素标准品(中国药品生物制品检定所)，柠檬酸钠、盐酸、乙酸钠(天津市科密欧化学试剂有限公司)，维生素B1片剂(10 mg，国药准字H12020592)和注射液(100 mg，国药准字H14022171)，二次蒸馏水、亚沸水(本实验室提供)，实验用玻璃容器均用新配制的王水(HCl/HNO3=3∶1)浸泡，洗涤后使用．

UV-1800PC紫外－可见分光光度计(中国上海美谱达)，F-4500荧光分光光度计(日本日立)，PHS-3C酸度计(上海雷磁仪器厂)，STP FA1004电子分析天平(上海上平仪器有限公司)，Tecnai G220s-twin高分辨型透射电子显微镜．

1．2 实验方法

采用柠檬酸钠法制备纳米金．取250 mL三口烧瓶，加入100 mL 0．01%氯金酸溶液，在磁力搅拌加热器上加热至沸，加入2．75 mL 1%柠檬酸钠溶液，继续煮沸12 min，停止加热，自然冷却至室温，转移至100 mL容量瓶中，4℃保存．

取2 mL制备的纳米金于5 mL容量瓶中，加入800 μL pH 2．3的盐酸－柠檬酸钠缓冲溶液，定容至刻度线．取2 mL加入缓冲的纳米金于比色皿中，依次加入1～13 μL维生素B1标准溶液，混合均匀，以水为参比测定各自的吸光度．根据纳米金溶液与维生素B1作用前后吸光度的变化值Δ(A625/A518)绘制标准曲线．Δ(A625/A518)=纳米金与维生素B1作用后的吸光度比值A625/A518－纳米金与维生素B1作用前的吸光度比值A625/A518．

2 结果与讨论

2．1 纳米金的表征

制备的纳米金为酒红色，其粒径及表观颜色都符合文献报道．纳米金的吸收曲线如图1所示，最大吸收波长在518 nm处，这是球形的纳米金粒子特有的表面等离子吸收峰，从而估算出纳米金粒子的粒径约为13 nm，浓度约为3．72 nM［16］．利用透射电镜(TEM)对制备的纳米金进行表征，从图中可以看出制备的纳米金为球形，粒径均匀，分散很好．

图1 纳米金的紫外－可见吸收光谱及透射电镜图Fig．1 The absorption spectra and photograph of TEM of gold nanoparticles

2．2 纳米金测定维生素B1

实验制备的纳米金粒子表面被大量的柠檬酸根离子包裹，由于静电排斥力纳米金能够稳定存在而不发生凝聚．维生素B1分子上带有氨基(—NH2)，在弱酸溶液中，维生素B1带正电(—NH+3)，由于静电作用力，维生素B1能够和纳米金发生相互作用，使纳米金粒子之间的距离变小，发生凝聚，利用透射电镜观察到作用后的纳米金，如图2所示，纳米金发生凝聚．凝聚后纳米金的紫外－可见吸收光谱发生红移和展宽，纳米金和维生素B1本身的共振散射峰很弱，凝聚后共振散射光谱增强，在此过程中，颜色由酒红色变为紫色最终变为蓝色．纳米金的凝聚程度用Δ(A625/A518)来表示，在一定范围内与维生素B1的浓度呈现良好的线性关系，据此建立了一种简单、快速测定维生素B1的比色分析新方法．

图2 纳米金与55 ng/mL维生素B1相互作用的透射电镜图，紫外－可见吸收光谱图及共振散射光谱图Fig．2 The photograph of TEM，absorption spectra and RRS spectra of gold nanoparticles with 55 ng/mL VB1

2．3 实验条件优化

在pH 2．0～7．0范围内，对比加入等体积等浓度的盐酸－柠檬酸钠缓冲溶液、盐酸－乙酸钠缓冲溶液和BR缓冲溶液对体系测定的影响(图3)，其中盐酸－柠檬酸钠缓冲溶液对纳米金的聚集及变色效果最好，在此基础上，考察了不同缓冲溶液加入量对体系测定的影响(图4)，最终选定800 μL pH为2．3的盐酸－柠檬酸钠缓冲溶液时，Δ(A625/A518)最大．这主要是因为pH过低，纳米金表面吸附的负电荷减少，不利于它与维生素B1的结合，pH过高时，维生素B1中质子化的氢解离，正电荷减少，也不利于与纳米金结合．

图3 不同缓冲溶液对体系的影响Fig．3 Effect of pH on the absorption ratio

考察纳米金的用量对体系测定的影响．改变纳米金的用量(1～3 mL)，实验结果表明，纳米金的浓度增大时，其最大吸收峰值增大，而Δ(A625/A518)降低，考虑到纳米金容易染色，因此实验选择2 mL纳米金．

考察反应时间对体系测定的影响．分别对加入不同浓度的维生素B1前后的纳米金体系连续测定1 h，结果表明，加入维生素B1前，其吸收光谱基本不变，加入维生素B1后，在20 min时凝聚程度都达到最大，20 min后吸收光谱基本不再变化，反应时间定为20 min．

2．4 标准工作曲线

在最优条件下，按照实验方法测定维生素B1，由Δ(A625/A518)对维生素 B1的浓度 c作图(如图5所示)，线性范围为5～55 ng/mL，线性回归方程为 Δ(A625/A518)= －0．073 4+0．019 7c(维生素 B1，ng/mL)，相关系数为 0．998，检出限(3σ)为 0．74 ng/mL．

图4 不同盐酸－柠檬酸钠加入量对维生素B1测定的影响Fig．4 Effect of buffer solution amount on the absorption ratio

图5 不同浓度维生素B1存在下纳米金的紫外－可见吸收光谱图Fig．5 UV-vis absorption spectra of GNPs in the presence of different concentrations of VB1

2．5 常见物质的干扰

按照试验方法，考察了常见的金属离子、氨基酸和结构类似的药物分子的干扰情况(表1)．结果表明，对于55 ng/mL维生素B1，常见的阴离子、金属离子、氨基酸和糖类对体系基本不干扰，表明该体系具有较好的选择性．

表1 常见物质的干扰(55 ng/mL维生素B1)Tab．1 Effects of coexistent substances(containing［VB1］=55 ng/mL)

2．6 样品分析

2．6．1 回收率试验

取维生素B1片剂20片，研细，精密称取适量(约相当于维生素B110 mg)，加少量盐酸溶解，滤纸过滤后，转移至棕色容量瓶中．按实验方法进行标准加入回收实验，精密量取适量样品溶液，分别加入标准溶液10 ng/mL、30 ng/mL，测定吸光度值，计算回收率，并重复测定3次．精密量取1 mL维生素B1注射液于100 mL棕色容量瓶中，同样按实验方法进行标准加入回收实验，精密量取适量样品溶液，分别加入标准溶液15 ng/mL、30 ng/mL，测定吸光度值，计算回收率，并重复测定3次，回收率均在95% ～105%之间，说明该方法可以用于实际样品的分析．

2．6．2 含量测定

精密量取适量维生素B1片剂及注射液样品溶液，按试验方法测定吸光度，并计算ΔA，根据标准工作曲线计算样品中维生素B1的含量．结果见表2．由以上测定结果可知，购买的维生素B1片剂及注射液含量均在标示范围90．0% ～110%之内，RSD较小，符合药品质量管理规定．

表2 维生素B1片剂及注射液中维生素B1的测定Tab．2 Results for the determination of VB1in tablet and injection

3 结论

本文采用柠檬酸钠还原氯金酸的方法制得粒径约为13 nm的纳米金．在酸性环境中纳米金与维生素B1发生相互作用，纳米金产生凝聚，使其最大吸收峰发生红移，由此建立维生素B1的比色测定方法．优化了溶液pH、纳米金的浓度以及反应时间．在最佳条件下，方法的线性范围为5～55 ng/mL，结果令人满意．用此方法分析了维生素B1片剂和注射液，所测结果和按药典方法测定结果相一致．实现了维生素B1的测定，方法简单，测定速度快，而且不需要昂贵的仪器及大量的分析试剂，在食品分析及环境监测方面有很好的应用前景．

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