金枪鱼(Katsuwonus pelamis)碎肉蛋白降压肽的酶解制备及活性研究*

张 朋 贺卯苏 迟长凤① 王 斌

(1. 浙江海洋学院海洋科学与技术学院 国家海洋设施养殖工程技术研究中心 舟山 316022;2. 浙江海洋学院食品与医药学院 浙江省海洋生物医用制品重点工程技术研究中心 舟山 316022)

血管紧张素转换酶(ACE)是一种分子量为15kDa膜结合糖蛋白, 当人体循环或者局部组织中ACE活性过高, 会促使血管紧张素I (十肽, 由肾素转化而来)的肽链C末端的组氨酸和亮氨酸残基水解形成具有增压作用的血管紧张素II (八肽), 同时促进具有促血管舒张作用的缓激肽P物质的水解, 导致血压升高。因此, 寻找合适物质, 抑制体内ACE的活性, 即可达到降低血压的目的。目前, 血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)是一类发展迅速的抗高血压药物, 如含巯基(–SH)或硫基(–SR)类的卡托普利(Captopril), 含羧基(–COOH)类的依那普利(Enalapril), 以及含次膦酸基(–POO–)类的福辛普利(Fosinopril)等。此类化学合成药物在应用过程中常引起患者咳嗽、味觉异常、粒细胞减少、皮疹、发热等不良反应, 给患者带来较强的不适感。与化学合成的ACEI相比较, 通过酶解食源性蛋白质获得的ACE抑制活性肽(ACEP)具有显著优点, 主要体现在: (1) 安全性高, 无毒副作用; (2) 原料来源广, 制备条件温和, 易于产业化; (3) 降压效果专一, 易于消化吸收。因此, 选择合适的蛋白酶在体外降解蛋白资源, 研究和开发出具有降血压作用的活性肽食品或药物, 成为研究的热点(Liuet al, 2013)。

目前, 已经成功地从多种水产资源中获得了ACEP。如徐怀德等(2008)利用碱性蛋白酶水解甲鱼蛋白获得具有ACE抑制作用的酶解物, 其对ACE的体外抑制率为99.96%。于娅等(2004)以牡蛎为原料制备的短肽在0.4 mg/mL时的ACE抑制率为51.4%。戴志远等(2009)利用酶解和Sephadex G-50柱层析从河蚌酶解物中得到2个分子质量分别为14.1 (MPP1)和12.7 kDa (MPP2)的组分, 其对ACE抑制作用的IC50分别为0.88和0.32 mg/mL。Fujita等(1999)利用嗜热菌蛋白酶水解鲤鱼得到6种降压肽, 分别为IY、IKP、LKP、IWH、LKPNM和IWHHT, 均能明显降低原发性高血压大鼠的血压, ACE抑制活性的IC50值分别为2.31、6.9、0.32、3.5、2.4和5.8μmol/L。Enari等(2008)酶解鲑鱼蛋白获得降压肽IW, ACE抑制活性检测显示其IC50值为1.2μmol/L。Jae等(2004)利用胃蛋白酶酶解鳕鱼蛋白, 利用色谱技术制备降压肽FGASTRGA, ACE抑制活性检测显示其IC50值为14.7μmol/L。Liu等(2013)利用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶水解水母蛋白, 利用色谱技术制备降压肽QPGPT和GDIGY, ACE抑制活性检测显示其IC50值分别为80.67和32.56μmol/L。Lee等(2014)利用胰蛋白酶酶解, 色谱制备, 从大马哈鱼鱼皮酶解物中制备降压肽GLPLNLP, ACE抑制活性检测显示其IC50值为18.7μmol/L。

金枪鱼(Katsuwonus pelamis)是世界远洋渔业的重要作业鱼种之一, 年产量超过600万吨, 占公海渔业总产量70%以上(罗红宇等, 2013; Shyniet al,2014)。在金枪鱼加工过程中产生的碎肉、鱼头、鱼皮和鱼骨等下脚料约占总重量的50%—70%。研究发现金枪鱼碎肉中粗蛋白含量很高, 是良好的蛋白质来源(杜帅等, 2013; 谭洪亮等, 2014)。然而, 我国金枪鱼下脚料的加工利用不尽如人意, 90%以上仍然作为饲料原料或初级饲料利用, 造成了金枪鱼资源的大量浪费, 也给生态环境带来了较大压力(杜帅等,2013)。因此, 高效的利用金枪鱼下脚料资源具有重要的意义。因此, 本实验以金枪鱼碎肉蛋白为原料进行ACEP的研发, 不仅会为高血压疾病的治疗提供候选药物, 还将为金枪鱼下脚料的综合利用提供一条可行的途径。

1 材料与方法

1.1 样品、试剂与仪器

金枪鱼(Katsuwonus pelamis)碎肉由宁波丰盛食品有限公司提供。Sephadex G-25购于安发玛西亚生物技术公司, 碱性蛋白酶购于上海源聚生物科技有限公司, 色谱纯乙腈购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司, 其他试剂为分析纯, 购于上海国药集团化学试剂有限公司。

Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);U-2800紫外可见分光光度计(日本日立集团); Anke TDL-40B离心机(上海安亭科技仪器厂); HD 21C-A核酸蛋白检测仪(上海康华生化仪器制造有限公司);DS-1高速组织捣碎机(上海精密仪器仪表有限公司);SC-15超级恒温槽(宁波江南仪器厂)。

1.2 实验方法

1.2.1 金枪鱼碎肉酶解物的制备 称取金枪鱼碎肉100g, 加入pH 10.0的甘氨酸 –NaOH缓冲液500 mL,于组织捣碎机内均质5 min, 用1mol/L HCl和NaOH将该混和物调pH至设定数值, 得混和液。将混合液温度升至预定温度搅拌预热, 并于搅拌状态下保温20 min; 然后加入预定量的碱性蛋白酶(酶活力≥1.9×104U/g), 在设定的时间下完成酶解之后, 放入95—100°C水浴15 min, 对酶灭活, 灭活液在4°C、4500 r/min离心30 min, 取上清液真空浓缩后冷冻干燥, 得酶解物(TPAP), 并于–20°C低温保存。

根据正交试验确定碱性蛋白酶水解金枪鱼碎肉蛋白的工艺条件。L9(34)正交试验设计因素和水平见表1。

表1 正交实验中酶解条件的因素水平表Tab.1 The factors and levels of enzymatic hydrolysis conditions

1.2.2 D101大孔吸附树脂对金枪鱼碎肉蛋白酶解物的脱盐工艺研究

(1) D101大孔吸附树脂对TPAP的静态吸附及解析实验 取 2.5 g预先处理的D101大孔树脂加入到250 mL具塞锥形瓶中, 用无水乙醇充分溶胀树脂,去离子水洗净无水乙醇, 再加入质量浓度为10 mg/mL的TPAP溶液150mL, 将锥形瓶放入25°C恒温摇床振荡12 h, 按照设定时间取样。选择水、30%乙醇、50%乙醇、75%乙醇和无水乙醇作为洗脱剂, 对已吸附TPAP并达到饱和的D101大孔树脂解吸24 h, 洗脱, 按下式计算树脂的吸附率、吸附量和解吸率。

吸附率(%) = [(原液浓度–吸附液浓度)/原液浓度]×100

吸附量(mg/g) = (原液浓度–吸附液浓度)×溶液体积/干树脂质量

解吸率(%) = {(解吸液浓度×解吸液体积)/[(原液浓度–吸附液浓度)×吸附液体积]}×100

(2) D101大孔吸附树脂对TPAP的动态吸附及解吸实验 在室温条件下, ① 质量浓度为10 mg/mL的TPAP分别以0.8 BV/h、1.5 BV/h、3 BV/h的流速经过层析柱; ② 质量浓度为 5 mg/mL、10 mg/mL和20 mg/mL的TPAP分别以1.5 BV/h的流速经过层析柱, 用紫外检测流出液的A220, 以A220= 0.05为透过点, 比较不同流速和浓度的穿透体积和吸附量。

1.2.3 超滤分级 TPAP用截留分子量为3 kDa和1 kDa的超滤膜超滤分级, 得三个组分: TPAP-I (MW＞ 3kDa)、TPAP-II (3kDa ＞ MW ＞1kDa)和TPAP-III(MW ＜ 1 kDa)。

1.2.4 Sephadex G-25凝胶过滤层析 取500.0 mg的TPAP-III溶于5 mL双蒸水中, 加入到预先平衡的Sephadex G-25凝胶柱(2.6×80cm)上, 用蒸馏水以1 mL/min的速度洗脱, 每5 min收集一管, 并于220 nm检测吸光度, 按峰合并, 得5个组分(TPAP-III-1—5)。

1.2.5 TPAP-III-4的反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析 TPAP-III-4经RP-HPLC分析为一个峰。RPHPLC条件为: 色谱柱Zorbax, SB C-18 (4.6×250mm,5μm, Agilent, USA); 流速1 mL/min; 检测波长220 nm;流动相: 乙腈/水梯度洗脱; 柱温25°C。

1.2.6 ACE抑制率试验 紫外分光光度法参照Cushmand(1971)和经Toriki(1993)改进的方法检测金枪鱼碎肉蛋白酶解物、超滤分段部位、Sephadex G-25分段部位的ACE抑制率。

量取0.25 mL反应液(K3PO4100 mmol/L, pH 8.3;NaCl 300 mmol/L; 马脲酰组氨酰亮氨酸(HHL)5 mmol/L)加入到试管中, 依次加入1 mL样品溶液(对照组加双蒸水), 0.15 mL ACE溶液(5 mmol/L)于反应液中, 37°C水浴保温30 min。加入1 mol/L的HCl 0.25 mL, 充分搅拌以终止反应。加入1.5 mL乙酸乙酯, 充分搅拌萃取反应生成的马尿酸, 收集上清液。将上清液于100°C水浴加热约20 min, 以蒸发掉乙酸乙酯, 然后加入3 mL蒸馏水, 充分振荡, 228 nm下测其吸光值。根据各酶解液反应值与空白样品对照, 计算所得样品的ACE抑制率。计算公式为:

式中,A为添加1mL样品时的吸光值;Acontrol为1mL蒸馏水代替1mL样品时的吸光值。

2 结果与分析

2.1 金枪鱼碎肉蛋白酶解物的制备工艺研究

影响蛋白酶解效果的因素主要有pH、反应温度、酶和底物浓度比(E/S)、酶解时间、底物浓度等, 并且不同因素之间还存在交互作用(Pihlanto-leppälä, 2001;Ranathungaet al, 2006)。本实验在预实验的基础上,以pH、酶用量、酶解温度、酶解时间为考察因素, 每个因素各取3个水平, 并以ACE抑制率为考察指标进行L9(34)正交试验, 结果见表2。

表2 碱性蛋白酶酶解金枪鱼碎肉蛋白制备降压肽的正交实验结果(n=3, c=10mg/mL)Tab.2 Orthogonal array design matrix L9(34) and experimental results for optimized the enzymolysis conditions of alcalase(n=3, c=10mg/mL)

从极差R值可以看出, 各因素对碱性蛋白酶酶解金枪鱼碎肉蛋白的影响程度依次为B＞C＞A＞D, 即酶用量是优化条件中影响最大的因素, 酶解时间的影响最小, 最佳酶解工艺条件为A2B3C2D2, 即pH 9.5,酶用量1.5%, 酶解温度50°C, 酶解时间5 h。按A2B3C2D2条件进行3次平行试验, 酶解物在10 mg/mL的浓度下的ACE抑制率达到71.43%±5.19%。

2.2 金枪鱼碎肉蛋白酶解物的脱盐工艺研究

2.2.1 大孔吸附树脂对金枪鱼碎肉蛋白酶解物的静态吸附能力 D101大孔吸附树脂对金枪鱼碎肉蛋白酶解物静态的吸附率和吸附量随时间的变化规律如图1和图2所示。结果表明: 静态吸附过程中, 2h内的吸附率和吸附量增加非常迅速, 而2h后吸附率和吸附量增加明显趋缓, 吸附平衡时的吸附率为88.11%±4.25%, 吸附量为(228.5±8.5)mg/g。

图1 D101大孔吸附树脂对金枪鱼碎肉蛋白酶解物吸附率随时间的变化(n=3)Fig.1 Absorption rate of D101 macroporous adsorption resin at varying time (n=3)

图2 D101大孔吸附树脂对金枪鱼碎肉蛋白酶解物吸附量随时间的变化(n=3)Fig.2 Absorption capacity of D101 macroporous adsorption resin at varying time (n=3)

2.2.2 D101大孔吸附树脂对金枪鱼碎肉蛋白酶解物的静态解析 表3结果表明: 所选解析液中,水的解吸率最低, 只有15.27%±1.23%; 而乙醇/水的解吸率随乙醇体积分数的增加而逐渐增大, 75%乙醇的解吸率可达到87.44%±3.29%, 但当采用无水乙醇时, 解吸率较75%乙醇有所下降, 为82.83%±4.38%。原因可能是部分分子量较大的金枪鱼碎肉蛋白酶解物在无水乙醇中溶解性较差, 导致解吸率下降。

表3 不同解吸剂对金枪鱼碎肉蛋白酶解物的解吸效果(n=3)Tab.3 Effect of different eluents on desorbing protein hydrolysate of tuna ground meat from D101 macroporous adsorption resin (n=3)

2.2.3 流速对D101大孔吸附树脂动态吸附性能的影响 流速主要影响溶质向树脂表面的扩散, 从而决定了固定床动态吸附效率。不同流速对D101大孔吸附树脂的穿透点体积和吸附量影响如表4所示。结果表明: 酶解物流速从0.8 BV/h、1.5 BV/h增加到3.0 BV/h时, 穿透点体积从(28.33±1.13)mL、(24.57±2.17)mL下降到(19.45±1.36)mL, 减小了31.3%; D101大孔吸附树脂对酶解物的吸附量也从(7.31±0.41)mg/g、(6.41±0.25)mg/g下降到(4.17±0.32)mg/g, 下降了43.0%。

实验结果表明: 随着酶解物流速的增加, 吸附速率也逐渐增大, 穿透点明显提前, 但D101树脂对酶解物的吸附量明显降低。因此, 金枪鱼碎肉蛋白酶解物经过D101大孔吸附树脂的流速确定为1.5 BV/h。

表4 不同流速时金枪鱼碎肉蛋白酶解物溶液的穿透点体积和吸附量(n=3)Tab.4 Volume of breakthrough point and adsorption capacity at different flow rates (n=3)

2.2.4 质量浓度对大孔吸附树脂动态吸附性能的影响 金枪鱼碎肉蛋白酶解物溶液质量浓度(5, 10,20mg/mL)对D101大孔吸附树脂穿透点体积和吸附量的影响如表5所示: 随着酶解物质量浓度的增加,穿透点体积从(26.75±1.59)mL、(20.47±1.24)mL变化为(15.32±1.08)mL, 说明D101吸附树脂随着样品质量浓度的增加, 吸附达到饱和的时间逐渐缩短, 树脂易于达到饱和。树脂对高浓度的酶解物具有高的吸附量, 酶解物浓度10mg/mL比5mg/mL时的吸附量增加了4.10 mg/g; 而20 mg/mL时的吸附量比10 mg/mL时增加了2.34 mg/g, 随着酶解物质量浓度的增加, 树脂的吸附量逐渐达到最大值。因此, 确定酶解物经过D101大孔吸附树脂的质量浓度为10 mg/mL。

表5 不同质量浓度金枪鱼碎肉蛋白酶解物溶液的穿透点体积和吸附量(n=3)Tab.5 Volume of breakthrough point and adsorption capacity at different concentrations of protein hydrolysate of tuna ground meat (n=3)

2.2.5 金枪鱼碎肉蛋白酶解物脱盐制备及ACE抑制率 根据上述结果, 确定金枪鱼碎肉蛋白酶解物脱盐的工艺条件为: 上样质量浓度10mg/mL、上样流速1.5 BV/h、解吸剂75%乙醇。在该工艺条件下对金枪鱼碎肉蛋白酶解物进行脱盐, 收集的洗脱液经真空浓缩和冷冻干燥后得到酶解物, 得率为65.35%±3.05%。结果表明, 脱盐后的金枪鱼碎肉蛋白酶解物在10 mg/mL浓度下的ACE抑制活性从71.43%±5.19%增加到81.76%±4.38%, 脱盐效果良好。

2.3 金枪鱼碎肉蛋白酶解物的超滤分级

金枪鱼碎肉蛋白酶解物(TPAP)用截留分子量为3 kDa和1 kDa的超滤膜超滤分级, 得三个组分: TPAP-I(MW ＞ 3kDa)、TPAP-II (3kDa ＞ MW ＞1kDa)和TPAPIII (MW ＜ 1kDa)。如图3所示: 在5 mg/mL浓度下,TPAP-I、TPAP-II和TPAP-III的ACE抑制率分别为65.38%±3.53%、85.81%%±2.85%和96.33%±3.07%。TPAP-III的活性高于总酶解物及其他超滤分段部位。

图3 金枪鱼碎肉蛋白酶解物及其超滤分级部分的ACE抑制率(n=3)Fig.3 ACE inhibition ratio of TPAP and its fractions by ultrafiltration (n=3)

据报道, 蛋白酶解物的生物活性与其分子量具有密切关系, 小分子量的多肽易于与靶点结合或通过血脑屏障而发挥其生物活性(Pihlanto-Leppälä, 2001;Ranathungaet al, 2006; Wanget al, 2012)。因此, TPAPIII的高活性与所含大量的低分子量多肽关系密切。

2.4 TPAP-III的Sephadex G-25凝胶过滤层析

图4表明: TPAP-III经Sephadex G-25凝胶过滤层析后得5个洗脱组分: TPAP-III-1、TPAP-III-2、TPAP-III-3、TPAP-III-4和TPAP-III-5。5个组分的ACE抑制率如图5所示: 在3 mg/mL和5 mg/mL浓度下, TPAP-III-4均显示出最强的ACE抑制率, 分别为43.4%±1.75%和73.25%±1.83%。

2.5 TPAP-III-4的纯度检测和氨基酸序列分析

图4 TPAP-III的Sephadex G-25凝胶过滤层析Fig.4 Gel filtration chromatography of TPAP-III on a Sephadex G-15 column

图5 TPAP-III的Sephadex G-25凝胶过滤层析分段部位的ACE抑制率(n=3)Fig.5 ACE inhibition ratio of fractions from TPAP-III

图6 TPAP-III-4的RP-HPLC图Fig.6 RP-HPLC chromatogram of TPAP-III-4

TPAP-III-4经RP-HPLC检测基本为单一峰(图6),纯度达到氨基酸序列分析的要求。利用Edman降解法经蛋白质序列分析仪测定TPAP-III-4的序列为Phe-Gly-Gly-Val (FGGV), ESI-MS检测给出分子离子峰m/z379.50 [M+H]+(图7), 与理论分子量378.42Da相吻合。

3 结论

图7 TPAP-III-4质谱图Fig.7 Mass spectrogram of TPAP-III-4

本实验以ACE抑制率为指标, 采用碱性蛋白酶从金枪鱼碎肉蛋白中制备降压肽, 极差R分析表明:酶用量是优化条件中影响最大的因素, 酶解时间的影响最小, 最佳酶解工艺条件为: 酶用量1.5%, pH 9.5, 酶解温度50°C, 酶解时间5h。利用D101大孔吸附树脂对酶解物进行脱盐处理的工艺条件为: 上样质量浓度10 mg/mL、流速1.5 BV/h、解吸剂75%乙醇。

脱盐酶解物经过超滤和凝胶渗透色谱分离纯化,得到ACE抑制率较好的单体降压肽Phe-Gly-Gly-Val(FGGV)。已有的研究证明寡肽相对于蛋白质或单一氨基酸具有更强的生物活性和更易在体内吸收的优点(Wanget al, 2012, 2013; Luoet al, 2013; Chiet al,2014)。Phe-Gly-Gly-Val (FGGV)为四肽化合物, 分子量小, 易于在人体内吸收, 从而更容易发挥较强的降压功效。另外, Cheung等(2009)发现活性较强的ACE抑制肽C端氨基酸一般为具环状结构的芳香族氨基酸(如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等)或脯氨酸; N端为长链或具支链的疏水氨基酸(如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等)或碱性氨基酸可以提高肽的抑制活性。综上分析可推知, Phe-Gly-Gly-Val (FGGV)具有强的ACE抑制活性是由于其分子量小、含有活性氨基酸及其氨基酸排列顺序等因素综合影响的结果。

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