金黄色葡萄球菌Fnb A配体结合区基因核酸疫苗的构建与免疫试验

尹荣兰 ，尹荣焕，白文林，李 琳，任清丹，许志林，李 卫，许 尧，杨正涛，张乃生

（1.吉林省畜牧兽医科学研究院，吉林 长春 130062；2.沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁 沈阳 110866；3.吉林大学畜牧兽医学院，吉林 长春 130062）

奶牛乳腺炎是由多种因素引起的严重影响奶牛业发展的重要疾病，奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌疫苗是当前研究的热点，主要因为，在引发奶牛乳腺炎的病原菌中，金黄色葡萄球菌存在最为广泛。另外，目前对金黄色葡萄球菌的基因组结构以及其主要表面蛋白和免疫反应研究较为清楚。其中FnbP 就是重要的粘附素之一，大多数菌株表达两个相似的FnbP 分子，即FnbA和FnbB，由两个相近的基因编码，目前分离到的大多数金黄色葡萄球菌都能够与细胞外基质上的纤维连结素特异性地结合[1]。FnbA分子结构中的D区被称作配体结合区，是主要的免疫优势表位，在研制金黄色葡萄球菌核酸疫苗中占有重要的作用。从30 多位有金黄色葡萄球菌感染病史病人的血清中分离得到IgG，证实这些IgG 片段均能与FnbP 特异性结合，采用FnbP 的重组缺失片段对抗原表位进行定位后发现，不同的IgG 均优先与配体结合区结合[2]。DNA疫苗是近年来出现的一种新型疫苗形式，能够同时诱导体液免疫和细胞免疫，在预防和治疗人和动物的疾病中发挥重要的作用，因此，奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌DNA疫苗也成为当今人们研究的一个热点[3]。

本试验基于基因疫苗的发展趋势，拟以引起奶牛乳腺炎的主要病原微生物金黄色葡萄球菌为研究对象，以其表面的特异性粘附素FnbA配体结合区基因（即FnbA的D1-D3 区，命名为pFnbA）为出发点进行奶牛乳腺炎基因疫苗的研制，设计引物对pFnbA基因进行克隆，以pVAX1 为真核表达载体，构建真核表达质粒，在细胞体外模型进行初步表达检测后，将其作为核酸疫苗开展了动物免疫试验研究，探讨了核酸疫苗作为奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌候选疫苗可行性。

1 材料与方法

1.1 菌株及载体 金黄色葡萄菌菌株由吉林大学畜牧兽医学院免疫实验室分离；大肠杆菌感受态细胞JM109 和载体pVAX1 由该室保存。pMD18-T 载体，购自TaKaRa 公司。

1.2 工具酶和试剂 Ex Taq DNA聚合酶，dNTP Mix，BamHI，EcoRI 等限制性内切酶，购自TaKaRa 公司；细菌基因组DNA回收试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；脂质体转染试剂（lipofectamineTMReagent），购自Invitrogen 公司；兔抗金黄色葡萄球菌多克隆抗体由军事医学科学院金宁一研究员惠赠（购自Meridian Life Science，USA）；Mouse Th1/Th2 ELISA（Ready-SET-Go!），购自eBioscience 公司；FITC标记的羊抗兔IgG，购自Sigma 公司。

1.3 实验动物 BALB/c 雌性小鼠，6～8 周龄，购自长春市生物制品研究所。

1.4 pFnbA基因的克隆 根据GenBank 收录凝集因子pFnbA基因（Accession No.J04151）序列，利用生物学软件设计特异性引物：

上游引物：5′-CCGGATCCGCCACCATGggcatcagaacaaaagacaact -3′；

下游引物：5′-CCGAATTCTTTActcagaggactcagt gtatcc -3′。

上下游引物5′端分别引入BamHI 酶切位点和EcoRI 酶切位点（划线部分），其中上游引物引入Kozak 序列，见阴影部分。

金黄色葡萄球菌基因组DNA的提取参照细菌基因组提取试剂盒说明书操作。PCR 反应参数如下：94 ℃预变性5 min 后，94 ℃，60 s；50 ℃，45 s；72 ℃，60 s，30 个循环，最后72 ℃延伸10 min。将扩增的pFnbA基因经回收后连入pMD18-T 载体，转化至大肠杆菌感受态JM109 中，提取质粒初步鉴定后，进行测序。

1.5 真核表达质粒pV-pFnbA的构建 将测序正确的阳性重组质粒pMD18-pFnbA和pVAX1 分别用BamHI 和EcoRI 双酶切，回收目的片段后，以T4DNA连接酶连接，连接产物转化到感受态细胞JM109 中，命名为pV-pFnbA，提取质粒进行鉴定。

1.6 体外表达检测 经过PEG8000 纯化后的阳性重组子pV-pFnbA质粒，用脂质体介导法转染长有60%～70%单层的HeLa 细胞玻片上，长到72 h 后，100 %冷丙酮固定30 min，用PBS洗涤3次后，用含有10% BSA的PBS封闭2 h，用PBS洗涤3 次后，加入一抗（兔抗金黄色葡萄球菌多克隆抗体），37 ℃作用2 h，用PBS洗涤3 次；接着加入FITC标记的羊抗兔IgG（含0.105 % 伊文斯蓝），37 ℃作用2 h 后，用PBS洗涤，于荧光显微镜下观察和拍照，同时设pVAX1 空质粒作阴性对照。

1.7 动物分组及免疫 将30 只6～8 周龄雌性BALB/ c 小鼠随机分为3 组，每组10 只，分别按100 μg/只腿部肌肉注射PBS对照组、空质粒pVAX1 及pV-pFnbA疫苗组，免疫3 次，间隔14 d，每隔10 d 采血一次检测抗体效价。

1.8 ELISA抗体检测 以大肠杆菌表达和纯化的pFnbA重组蛋白作包被抗原，运用间接ELISA方法检测小鼠血清中抗体水平变化。

1.9 Th1/Th2 类细胞因子水平检测 免疫小鼠眼眶采血后分离血清，用Mouse Th1/ Th2 ELISA试剂盒测定各细胞因子浓度。

1.10 T 细胞增殖试验 小鼠3 免后10 d 处死取脾，测定T 细胞增殖情况。

2 结果

2.1 活性基因pFnbA的克隆与获得 测序结果表明，pFnbA基因全长370 bp，对pFnbA基因通过GenBank 的Blastn 进行序列比较分析，表明pFnbA基因DNA序列非常保守，是构建金黄色葡萄球菌疫苗和进行分子生物学诊断的理想靶序列。

2.2 pV-pFnbA的构建与鉴定 质粒pV-pFnbA经BamHI 和EcoRI 双酶切，得到约3 kb 的pVAX1载体片段和400 bp 左右的目的基因片段（图1），表明成功构建出含有pFnbA基因的真核表达质粒pV-pFnbA。

图1 pV-pFnbA质粒的酶切鉴定

图2 核酸疫苗质粒转染HeLa细胞的荧光照片

2.3 目的基因的体外表达检测 利用间接免疫荧光法对外源基因进行检测，将处理好的细胞玻片置于荧光显微镜下观察，转染质粒pV-pFnbA的细胞玻片上有明显的黄绿色荧光（图2A），而对照细胞则无特异性荧光（图2B），说明真核表达质粒能在体外进行表达，并具有抗原性。

2.4 ELISA抗体水平 小鼠分组免疫后，采用间接ELISA方法测定小鼠血清中特异性抗体水平的变化，结果如表1 和图3 所示。由表1 和图3 可以看出，所构建的核酸疫苗能诱导机体产生特异性抗体，且抗体水平高于pVAX1 对照组及PBS组(P＜0.01)，在第10 d 后采血时免疫组的抗体水平呈快速升高。

表1 免疫小鼠ELISA抗体检测

图3 血清中ELISA抗体检测

2.5 Th1/Th2类细胞因子检测结果 利用（Mouse Th1/Th2 ELISAReady-SET-Go!kit，eBioscience）鼠类细胞因子检测试剂盒对各免疫组小鼠的细胞因子浓度（包括Th1 类细胞因子IL2、IFN-γ和Th2 类细胞因子IL-4、IL-10）进行了测定，通过绘制标准曲线，根据直线回归方程，计算样品Th1/Th2 类细胞因子含量，结果如图4 所示。由图4 可以看出，免疫组细胞因子含量均升高（P＜0.05）。同时，也说明DNA疫苗对无论对Th1 类细胞因子（IL-2、IFN-γ）还是Th2 类细胞因子（IL-4、IL-10）的分泌都有明显的刺激作用，但主要以Th1 类细胞因子为主。

图4 细胞因子含量检测

2.6 T 细胞增殖试验 3 免后10 d 捕杀小鼠取脾脏制备T 淋巴细胞悬液，分别用制备的重组蛋白和刀豆蛋白A（ConA）进行刺激，检测淋巴细胞特异性与非特异性刺激指数，结果如图5 所示。由结果可以看出，免疫组与对照组相比，其特异性与非特异性刺激指数均有明显提高且相差显著（P＜0.05）。表明DNA疫苗能刺激T 细胞增殖，诱导以细胞免疫为主的免疫应答。

图5 脾脏T淋巴细胞增殖反应

3 讨论

奶牛乳腺炎是由多种因素引起的严重影响奶牛业发展的重要疾病，由金黄色葡萄球菌引发的奶牛乳腺炎在世界范围内都造成了巨大的损失，研制新型疫苗是最终预防和控制奶牛乳腺炎发生的必然趋势[4]。

Fnbp是金黄色葡萄球菌粘附于寄主细胞的最主要的黏附因子之一，能够介导金黄色葡萄球菌结合于细胞表面的纤维粘连素（Fn），使细菌粘附于寄主细胞表面，促进细菌对寄主组织的入侵[5]。Aart Lammers 等的研究表明，缺乏纤连素结合蛋白表达的金黄色葡萄球菌菌株不能凝集细胞，并且粘附、侵入牛乳腺细胞的能力显著降低[6]。通过对奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌FnbA和FnbB基因进行双重PCR检测，试验发现95%以上金黄色葡萄球菌存在黏附素基因FnbA，而FnbB基因仅10%，证实了FnbA在金黄色葡萄球菌侵袭奶牛乳腺的过程中起到了重要作用，其中由3个重复的D区（D1-D3）形成的结构域是主要的配基结合区域，研究表明用该区免疫后产生的抗体能有效阻断配体结合区与Fn 的结合[7]。Sun等使用FnbA配体结合区的短片段（FnbA的D1-D3区）免疫后证实，由此产生的抗体能有效阻断配体结合区与Fn 的结合。因此，FnbAD1-D3 对于金黄色葡萄球菌粘附并侵入牛乳腺细胞是必须的和重要的[2]。Lulzim Shkreta 等报道在感染金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎中，这两种序列是FnbA的D121-34；D320-33 和ClfA的氨基酸221-550 序列，用构建的DNA疫苗免疫怀孕7个月的奶牛，结果表明，免疫的牛产生了抗D1、D3 和ClfA的功能性抗体，表明pFnbA和ClfA的蛋白免疫牛有比较好的免疫激发条件[8]。

本试验以金黄色葡萄球菌为研究对象，通过克隆其主要抗原基因pFnbA，构建了候选重组核酸疫苗质粒，小鼠免疫试验结果表明，所构建核酸疫苗重组体能刺激机体产生有效的免疫应答，但主要是细胞免疫，为进一步探讨金黄色葡萄球菌核酸疫苗的应用提供了原始实验数据，为研制奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌的新型疫苗奠定了基础。

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