牛肠道病毒2型VP1+表达和间接ELISA方法的建立与应用

郭金玉，高志强，张鹤晓，张乐萃，吴 丹

（1.青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛266109；2.北京出入境检验检疫局，北京 朝阳100026）

牛肠道病毒（Bovine enterovirus，BEV）是小RNA病毒科、肠道病毒属成员[1]。BEV呈L434结构，球形，无囊膜，大小约为25～30 nm，单股正链RNA病毒。BEV分为2型：BEV-1和BEV-2。据资料报道，在世界其他各国，牛肠道病毒病经常在牛群及其周围环境中流行[2]。在中国，有关此病流行的报道很少。2005年初北京某牛场发生牛肠道病毒感染，引起奶牛严重腹泻，降低了其生产性能，吴丹等从中分离得到1株牛肠道病毒毒株[3]，对其进行全基因测序后，确定为BEV-2。2008年，李英利从犊牛粪便中分离出了1株肠道病毒[4]，但不确定其基因型。

BEV一般呈隐性感染，通常只引起轻微的下痢和呼吸道症状，但在某些恶劣环境下，动物突发应激导致抵抗力下降时，可引起奶牛发生严重的腹泻，使产奶量大大下降，给畜牧业带来极大的损失。因此，对BEV-2预防和诊断技术的研究日益受到人们的重视。为了建立检测BEV-2抗体的间接ELISA方法，本研究利用原核高效表达系统在大肠杆菌中表达BEV-2型VP1+蛋白，通过对临床样品进行检测，表明该方法具有良好的特异性及重复性。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 TRIZol，购自Invitrogen公司；DNA片段回收试剂盒、限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ、质粒快速提取纯化试剂盒，购自TaKaRa公司；M-MLV反转录酶、RNA酶抑制剂、Taq DNA聚合酶，购自Promega公司；HRP标记的rec Protein G，购自北京博奥星生物技术有限责任公司。

1.2 病毒、质粒、宿主菌及阳性血清 BEV-2病毒（毒株BJ001），北京检验检疫局检验检疫技术中心提供；原核表达质粒pET-32a，本实验室保存；大肠杆菌（E.coli）Top10、Rosetta，购自北京康为世纪生物科技有限公司；BEV-2阳性血清，用BEV-2病毒免疫阴性牛制备。

1.3 牛肠道病毒2型VP1+基因扩增、克隆 用DNAMAN软件将毒株BJ001的全基因序列与Gen-Bank数据库中提交的BEV序列进行比对和分析，然后用Primer Premier 5.0设计引物，扩增包含VP1（840 bp）蛋白基因片段的VP1+（1 275 bp）序列。引物名称、序列见表1。

表1 BEV-2的引物名称和序列

提取BEV-2病毒核酸，以BEV2-VP1-f、BEV2-VP1-r为引物，进行RT-PCR扩增，扩增条件如下：94℃变性2min后进入循环，循环参数是94℃45 s、51℃45 s、72℃1min，40个循环后，72℃延伸10 min。将扩增的基因片段克隆至pMD-T19载体并转化至大肠杆菌Top10中，筛选阳性克隆子，测序正确后，放置-80℃保存。其质粒命名为pMD-T19-BEV2-VP1+。

1.4 原核表达载体的构建及鉴定 将质粒pMDT19-BEV2-VP1+和原核表达质粒pET-32a同时经限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ双酶切，用连接酶连接过夜，次日转化至大肠杆菌Top10。挑取单克隆菌落扩大培养后，对菌液进行PCR鉴定，鉴定正确的送公司测序。将重组质粒命名为pET-32a-BEV2-VP1+。

1.5 重组蛋白的诱导表达及优化 将重组质粒pET-32a-BEV2-VP1+转化到Rosetta宿主菌，培养一定时间后，加入IPTG诱导表达，取诱导前后的菌液，12 000 r/min离心10min，收集菌体，充分裂解后，加入等体积的2×SDS-PAGE上样缓冲液，100℃煮沸5 min。取10μL进行SDS-PAGE电泳，电泳显示该蛋白为包涵体表达。

对培养温度、诱导时间以及加入IPTG的终浓度等一系列条件进行优化。

1.6 包涵体蛋白的洗涤、溶解 将包涵体用含2mol/L、4mol/L、6mol/L尿素的Tris缓冲液依次进行洗涤后，再用含8 mol/L尿素的Tris缓冲液溶解，最后进行SDS-PAGE检测。

1.7 蛋白的纯化、复性 蛋白纯化用HIS.BIND resin蛋白纯化试剂盒在变性条件下进行。

将纯化后的蛋白装入透析袋中，透析梯度依次为6mol/L、4mol/L、2mol/L、0mol/L尿素的Tris缓冲液，进行透析复性。蛋白复性后，用Westernblot检测其反应原性。

1.8 间接ELISA方法的建立

1.8.1 间接ELISA反应条件的确定 （1）抗原、血清工作浓度的确定：用碳酸盐缓冲液将抗原按1∶50、1∶100依次倍比稀释至1∶6 400包被酶标板；用含1%BSA的PBST将阳性血清、阴性血清按1∶20、1∶40、1∶80、1∶160稀释，进行ELISA方阵试验，测其OD450nm值，来确定抗原包被浓度和血清最佳工作浓度；（2）酶标蛋白G工作浓度的测定：确定抗原和血清最佳工作浓度后，将酶标蛋白G作1∶500、1∶1 000、1∶1 500稀释，进行间接ELISA，测其OD450nm值。

1.8.2 封闭液的确定 分别以5%脱脂奶粉、1%牛血清白蛋白和1%卵清蛋白封闭，比较封闭效果。

1.8.3 临界值的确定 按优化好的条件对30份BEV-2阴性血清样品进行间接ELISA测定，用酶标仪检测OD450nm值，以OD平均值（-x）加3个标准差（SD）作为判定的临界值[5]，待检血清高于此值的判为阳性。

1.8.4 间接ELISA的特异性 用间接ELISA方法检测IBR阳性血清、BVDV阳性血清、BLV阳性血清、BEV-2阳性血清，验证该ELISA方法的特异性。

1.8.5 间接ELISA的重复性 用重组蛋白包被ELISA板，选取4份血清样品，重复4孔，进行板内重复性试验；用重组蛋白分别包被3块ELISA板，检测板间重复性，对检测结果进行统计学分析后，分别计算板内和板间变异系数。

1.9 临床样品检测 用建立的间接ELISA方法检测美国、澳大利、新西兰、加拿大进口牛的血清及国内牛血清，统计阳性率。

1.10 间接ELISA与中和试验结果分析比较 用建立的间接ELISA方法对45份不同中和效价的BEV-2阳性血清做倍比稀释，测其ELISA效价，与中和效价进行分析比较。

1.11 ELISA包被板保存期的确定 将包被的蛋白酶标板（蛋白包被时加入0.01%叠氮钠）密封后置于4℃冰箱中保存1个月、3个月、6个月、9个月、12个月进行间接ELISA检测，测定其稳定性。

2 结果

2.1 牛肠道病毒2型VP1+蛋白扩增结果 对牛肠道病毒2型VP1+蛋白基因进行RT-PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳可见1条与预期大小（1 275 bp）相符的DNA片段，见图1。

图1 RT-PCR扩增结果

2.2 原核表达载体的构建与序列分析 将克隆到pMD-T19载体的目的片段和原核表达质粒pET-32a同时经限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ双酶切，用连接酶连接过夜，成功构建了原核表达载体pET-32a-BEV2-VP1+。将重组质粒进行测序，测序结果与原序列一致。

2.3 重组蛋白的诱导表达 将重组质粒pET-32a-BEV2-VP1+转化至Rosetta宿主菌后，在37℃温箱培养1段时间后，加入IPTG进行诱导表达，SDS-PAGE显示在预期分子量大小处即52kDa出现大量表达的特异蛋白条带（图2）。

图2 SDS-PAGE电泳结果

2.4 重组蛋白的表达条件优化 经摸索确定最佳表达条件为菌液培养至OD600nm数值到达0.6时，用0.6mmol/L IPTG在37℃诱导4 h，目的蛋白为包涵体表达，最终溶于8mol/L尿素中。

2.5 重组蛋白的纯化与复性 纯化后得到高纯度的重组蛋白（图3）。Western-blot结果表明重组蛋白具有良好的反应原性。

图3 纯化后的重组蛋白

2.6 间接ELISA方法的建立

2.6.1 间接ELISA反应条件确定 经测定，抗原包被浓度为1.56μg/mL，37℃温箱作用1 h后4℃放置过夜；血清最佳工作浓度为1∶40；酶标蛋白G 1：1 000稀释时，P/N值相对较大。

2.6.2 封闭液的确定 封闭液用含1%牛血清白蛋白的PBST封闭，37℃作用2 h效果最好。

2.6.3 临界值的确定 测定30份BEV-2阴性血清，其OD450nm值的-x为0.1762，SD值为0.07211，临界值为-x+3SD=0.3925。

2.6.4 间接ELISA的特异性 间接ELISA结果显示，BEV-2阳性血清为阳性。IBR阳性血清、BVDV阳性血清、BLV阳性血清OD450nm值均小于0.3925，为阴性。

2.6.5 间接ELISA的重复性 经测定计算，板内变异系数为2.20%～7.56%，板间变异系数为2.28%～8.42%，均小于10%，证明该方法准确、可靠、重复性高。

2.7 临床样品检测 用建立的间接ELISA方法检测362份不同国家牛血清，数据显示：除加拿大以外其他各国阳性率均高达80%以上（表2）。

表2 对不同国家牛血清的检测

2.8 间接ELISA与中和试验（NT）结果分析比较

两种方法同时检测45份牛血清，阳性符合率为50%，阴性符合率为55.2%，总符合率为53.3%。结果显示，血清的中和效价和ELISA效价不成正相关（表3）。

表3 NT和间接ELISA的符合率试验结果

2.9 ELISA包被板保存期的确定 试验结果显示，蛋白包被时加入叠氮钠对试验结果没有影响，保存于4℃1～6个月的ELISA包被板阴阳性血清的变异系数均小于10%，ELISA包被板保存期为6个月。

3 结论与讨论

目前，国内外对BEV-2的研究较少，本研究根据BEV-2病毒（毒株BJ001）设计引物，摸索并优化出VP1+蛋白序列的诱导表达条件，表达的重组蛋白溶于8mol/L尿素中，且保持较好的反应原性。用重组蛋白BEV-2 VP1+作为包被抗原，并用HRP标记的rec Protein G为二抗，在国内率先建立了BEV-2的间接ELISA检测方法。

牛肠道病毒通常是轻度或不显性感染，在发生应激、体质虚弱等情况下可引发显著症状，导致牛发生多种综合征，这不仅严重降低了奶牛的生产性能，而且还有污染奶制品的可能。跟踪调查显示，目前该病两年就发生1次，发生这一现象的原因可能是：当动物处于恶劣环境下，其抵抗力会下降，导致机体发病；发病后体内抗体升高，维持一段时间后抗体开始下降，从而导致再次发病。本试验通过对不同国家进口牛血清的检测（进口牛血清来自不同国家的不同牛场），可以看出美国、澳大利亚、新西兰和国内牛血清阳性率非常高，均在80%以上。之所以会出现BEV-2在美国、澳大利亚、新西兰和我国牛高阳性率的原因可能有两点：一是BEV-2在环境中非常稳定，能在环境中存在很长时间，感染后多数为亚临床表现，不易被发现；二是跟放牧形式有关，以上4个国家多采用密集型放牧形式，牛群之间密切接触，一旦有牛感染，BEV-2就会在牛群中广泛存在。加拿大牛的血清相对来说阳性率比较低，只有35%，可能与加拿大饲养方式和牛群间相距较远有关。据报道，在广延性的放牧地区，感染牛肠道病毒的机率较低。加拿大采取了低密度饲养动物的措施，大大降低了牛肠道病毒在环境中暴发的危险系数。

将中和试验和间接ELISA试验结果进行比较，可以看出二者的抗体效价不呈现正相关，原因可能是BEV-2的中和位点并非全部落在扩增的目的蛋白序列VP1+上。

本试验建立的检测牛肠道病毒2型抗体的间接ELISA方法操作简单、快捷、具有较高实用价值，该诊断方法将有望更广泛地应用于临床病例的诊断和血清学普查。下一步，拟用表达的重组蛋白制备单克隆抗体。

[1]Smyth M S，Martin JH.Structural.biochemical and electrostatic basis of serotype specificity in bovine enteroviruses[J].Arch Virol，2001，146（2）：347-355.

[2] Goens SD，Botero S，Zem la A，et al.Bovine enterovirus 2：complete genomic sequence and molecularmodelmodelling of a references strain and awild-type isolate from endemically infected US cattle[J].JGen Virol，2004，85（11）：3195-3203.

[3]彭小薇，董浩，张鹤晓，等.牛肠道病毒2型的分离与鉴定[J].畜牧兽医学报，2013，44（5）：23-828.

[4] 李英利，常继涛，于力.牛肠道病毒的分离鉴定[J].中国预防兽医学报，2011，5：51-55.

[5]杜平.医用实验病毒学[M].北京：人民军医出版社，1985．