河西走廊盐碱土壤中抗立枯丝核菌的放线菌筛选

河西走廊盐碱土壤中抗立枯丝核菌的放线菌筛选

王蓓 牛世全 达文燕 李海云 胡娇龙 赵国杰
（西北师范大学生命科学学院 旱区微生物资源与生态研究所，兰州 730070）

从甘肃省河西走廊盐碱土中分离所得50株放线菌中，筛选出对立枯丝核菌有生防潜能的放线菌，旨在为生物防治作物病害提供新的菌种资源。通过平板对峙法、生长速率法及活体组织法筛选拮抗菌，并对其进行形态及分子鉴定。经过平板初筛，有4株菌株对立枯丝核菌有拮抗作用，编号Ⅰ18-5-2、Ⅲ22-3-12、Ⅳ16-3-2、DC009-1-23，其中Ⅳ16-3-2和DC009-1-23有较高的拮抗性，抑菌圈直径分别为20.5 mm和15.5 mm；进而对这2菌株进行发酵液复筛，菌丝的生长抑制率分别为89.02%和80.49%；活体组织试验表明，Ⅳ16-3-2和DC009-1-23对立枯丝核菌的防治效果分别达54.29%和45.71%；通过形态培养特征和16S rDNA序列鉴定，将菌株Ⅳ16-3-2初步鉴定为变异链霉菌，DC009-1-23为丁香链霉菌。

立枯丝核菌 放线菌 盐碱地 生物防治

立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）是一种严重危害农作物的土传病原菌（也可侵染叶片），可引起多种农作物的病害［1］。由立枯丝核菌引起的立枯病发生比较普遍，危害严重，可引起多种蔬菜瓜果和农作物的病害，如油菜立枯病、水稻纹枯病等。目前尚缺乏对立枯丝核菌有效的抗病品种，主要通过农艺措施和化学药剂拌种的方法进行防治［2］。但目前使用化学杀菌剂防治时由于其药效持续时间短，因而农民使用药剂的次数和剂量逐步增加，其有害物质在蔬菜、土壤中的蓄积量也逐渐增加，这种情况在温室大棚蔬菜栽培中尤为突出，对人体健康和生态环境构成极大危害［3］。

真菌病害生物防治是克服病害化学防治造成环境污染、破坏生态平衡等缺点的有效途径［4］。应用于立枯丝核菌的生防因子很多，其中主要包括真菌、细菌（包含放线菌）等［1］。放线菌是产生抗生素的

主要微生物来源，在微生物产生的10 000多种生物活性物质中，有50%以上是放线菌产生的，堪称为次级代谢物的宝库，应用放线菌的生物资源有着巨大的社会效益和生态效益［5］。放线菌的抗生作用体现在次级代谢产物即抗生素对病原菌直接的抑制和致死作用。由于土壤中发现放线菌新种的几率越来越小，因此研究者把目光集中到特殊生境区域［6-10］。

本研究从甘肃省河西走廊盐碱土中分离放线菌，以期从中筛选出对立枯丝核菌有生防潜能的放线菌，这将为生物防治作物病害提供新的菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：由本研究所分离自甘肃省河西走廊盐碱土壤中。供试靶标菌：立枯丝核菌，由甘肃省农科院植保所提供。主要培养基：PDA培养基，高氏一号培养基，小米浸液培养基。

1.2 方法

1.2.1 放线菌的活化 采用高氏一号培养基，28℃培养14 d后转接于相应的斜面培养基备用。

1.2.2 放线菌对立枯丝核菌的直接拮抗作用 对分离到的50株放线菌，采用平板对峙法［11］进行平板初筛。分别将在PDA培养基上培养3 d的立枯丝核菌菌饼（直径8 mm）接种于另一PDA平板中心，并将培养5 d的放线菌边缘菌饼（直径8 mm）对称接种在距中心2.5 cm处，重复3皿，以不接放线菌为对照。（25±1）℃培养3 d后测量其抑菌圈大小。

1.2.3 放线菌发酵液对立枯丝核菌抑菌活性的测定

1.2.3.1 发酵液的制备 待测菌株在高氏一号斜面培养基上28℃恒温培养7-10 d，待其产生足量的孢子后制备菌悬液［12-16］。

1.2.3.2 抑制菌丝生长速率法 将放线菌菌株发酵液原液与PDA培养基按照1∶9的比例混合后，倒入直径为9 cm培养皿内制成带菌培养基，重复3次，以混合无菌水的PDA培养基为对照。将病原菌饼（8 mm）接种于带菌培养皿内，菌丝面朝下，28℃培养3 d，用十字交叉法测量菌落扩展直径，求出菌丝生长抑制率［17，18］。

菌丝生长抑制率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径/对照菌落直径）×100%

1.2.4 活体组织试验 采用组织法［19］测定发酵液对立枯丝核菌的室内药效，剪取生长良好的油菜叶片，清洗掉表面的杂物，晾干后在含有0.1% Tween-20供试发酵液中浸渍3 min，自然晾干。挑取病原菌饼倒扣在叶片中部，每个叶接种1个菌饼，未经发酵液处理的叶片作为空白对照，每处理重复5次。将处理好的叶片放置在9 cm培养皿中保湿48 h，检查病斑的大小。

抑制活性（%）=（1-处理病斑生长直径/对照病斑生长直径）×100%

1.2.5 菌株的鉴定 形态学鉴定：采用插片法［20，21］，将菌株划线接种在高氏一号培养基上，在接种点附近斜插入灭菌的盖玻片（1 cm×1 cm），28℃培养7 d后，取出盖玻片在光学显微镜下观察菌丝及孢子丝形态。

分子学鉴定：供试菌株DNA提取参照黄大林［21］的方法。

16S rDNA序列扩增和分析。 引物序列：P1：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'P2：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA -3'。

PCR反应体系为25 μL，含上下游引物各1 μL、12.5 μL Premix ExTaq DNA聚合酶（由日本TAKARA公司生产）、2 μL DNA模板、8.5 μL ddH2O。扩增程序为95℃预变性5 min，95℃变性30 s，58℃复性30 s，72℃延伸2 min进行32个循环，72℃延伸5 min。

PCR扩增产物送华大基因公司测序，所得序列与GenBank数据库中序列进行BLAST分析比对，采用MEGA3.1软件构建系统发育树，并且进行同源性分析。

2 结果

2.1 抗立枯丝核菌放线菌的离体筛选

2.1.1 50株放线菌对立枯丝核菌拮抗作用测定结果 采用平板对峙法对50株放线菌进行拮抗性初筛。试验结果如表1，有4株菌株即Ⅰ18-5-2、Ⅲ22-3-12、Ⅳ16-3-2、DC009-1-23对立枯丝核菌有不同程度的拮抗活性。其中Ⅳ16-3-2、DC009-1-23有较大的抑菌活性，抑菌圈直径大于15 mm（图1）。

2.1.2 两株活性菌株发酵液对立枯丝核菌的抑制作用 利用生长速率法对初筛中对立枯丝核菌具有较

高拮抗性的2株放线菌（Ⅳ16-3-2、DC009-1-23）进行活性复筛。这2株放线菌发酵上清液的10倍稀释液对立枯丝核菌的生长抑制活性筛选结果如表2所示，菌株Ⅳ16-3-2、DC009-1-23对立枯丝核菌的抑制活性均达到80%以上，抑菌效果显著。

表1 拮抗放线菌对立枯丝核菌的初筛平板拮抗效果

图1 菌株IV 16-3-2、DC009-1-23对立枯丝核菌的拮抗作用

表2 两株高拮抗性放线菌发酵液对供试靶标菌抑制率平均值

2.1.3 活体组织测定结果 对菌株Ⅳ16-3-2、DC009-1-23进一步进行活体组织试验，测定菌株Ⅳ16-3-2、DC009-1-23发酵液原液对油菜立枯病菌的药效，结果如表3所示，其中Ⅳ16-3-2株菌的发酵液原液对油菜立枯病的药效达到50%以上，药效显著（图2）。

图2 菌株IV 16-3-2、DC009-1-23对离体叶菌丝扩展的抑制作用

2.1.4 菌株Ⅳ16-3-2、DC009-1-23的鉴定

2.1.4.1 Ⅳ16-3-2、DC009-1-23的形态特征 Ⅳ16-3-2在高氏一号培养基上气丝蓝灰色，基丝黄色，孢子丝卷曲长链，孢子椭圆形。DC009-1-23在高氏一号培养基上气丝近于藕荷色，基丝甘草黄色，孢子丝直，孢子椭圆形至柱形，表面光滑（图3）。菌株Ⅳ16-3-2、DC009-1-23是典型的链霉菌属菌丝形态。

图3 IV 16-3-2、DC009-1-23在高氏培养基上的菌丝形态

2.1.4.2 菌株系统发育分析 经PCR扩增、测序及与GenBank核酸数据库比对，构建系统发育树

和同源性分析结果显示（图4），菌株Ⅳ16-3-2与Streptomyces variabilis（变异链霉菌）关系紧密，位于同一分支，同源性高达98%、DC009-1-23与Streptomyces lilaceus（丁香链霉菌）关系最紧密，位于同一分支，相似度高达99%。

图4 邻接法构建菌株Ⅳ16-3-2、DC009-1-23的16S r DNA序列系统发育树

3 讨论

本试验采用平板对峙法和生长速率法对分离的放线菌进行初筛和复筛，平板对峙法的拮抗活性与菌丝生长速率、营养竞争和抗菌活性物质等多种因素有关；而生长速率法是菌体产生的胞外活性物质对病菌生长抑制作用的表现，是抗生素研究的基础。菌株Ⅳ16-3-2和DC009-1-23对立枯丝核菌的生防作用较为明显，其中Ⅳ16-3-2对离体油菜叶的防治效果突出。拮抗菌的盆栽试验及菌株活性物质的提取还有待进一步研究。

我国已经登记注册的农用抗生素有几十种，绝大多数抗生素产生菌为链霉菌属，其中链霉菌已成为放线菌中数量最多而且产生抗生素种类也最多的一个属［1］。本研究在传统分类原则的基础上，通过分子生物学方法对目的生防菌株进行了分类鉴定，两株菌株也均为链霉菌属［22，23］。

Byung等将玫瑰放线菌（Actinomadura roseola）等液培后分离提取出抗生素Da2B，它对立枯丝核菌有明显的抑制作用。井冈霉素是防治水稻纹枯病非常理想的生物农药，它是由吸水链霉菌井冈变种（Streptomyces hygroscopicus var.jinggangensis Yen） 产生的。井冈毒素对水稻纹枯病的防效高、持效期长［24］。本研究中DC009-1-23、Ⅳ16-3-2两株拮抗菌发酵液的抑菌率均高达80%以上，对于发酵液中拮抗物质的提取有待于进一步研究。

极端环境下如盐碱地、高寒地带等环境中的放线菌，由于生存环境特殊，代谢途径与常规放线菌不同，因而成为新的拮抗物质的重要来源［9］。从河西走廊盐碱土壤中分离所得放线菌有较多对立枯丝核菌有生防作用的菌株，这些拮抗菌在供试病原菌的生物防治上有重要的应用价值，应进行深入研究。甘肃省河西走廊盐碱地这种独特类型的土壤中，还有大量的链霉菌资源等待进一步开发。

4 结论

经过平板初筛，有4株菌株对立枯丝核菌有拮抗作用，其中Ⅳ16-3-2和DC009-1-23有较高的拮抗性，抑菌圈直径分别为20.5 mm和15.5 mm；菌株Ⅳ16-3-2、DC009-1-23对立枯丝核菌的抑制活性均达到80%以上，抑菌效果显著；菌株Ⅳ16-3-2发酵液原液对油菜立枯病的药效达到50%以上，药效显著；将菌株Ⅳ16-3-2初步鉴定为变异链霉菌，DC009-1-23为丁香链霉菌。

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（责任编辑 李楠）

Screening of Actinomyces on Antagonism to Rhizoctonia solani Isolated from Saline-alkali Soils in Hexi Corridor

Wang Bei Niu Shiquan Da Wenyan Li Haiyun Hu Jiaolong Zhao Guojie
（Institude of Arid Microbial Resources and Ecology，College of Life Science，Northwest Normal University，Lanzhou 730070）

This study selected several actinomycetes from 50 strains of the saline-alkali soils of Hexi Corridor in Gansu Province which have been proved to be resistant to Rhizoctonia solani by antagonistic test, which would provide new strains resources in crop disease control. Pair culture method, growth rate method and tissue culture method were used to select antagonistic bacteria. The results of antagonistic test showed that there were 4 strains with antagonism to Rhizoctonia solani, which were namedⅠ18-5-2, Ⅲ22-3-12, Ⅳ16-3-2 and DC009-1-23. From above four strains, Ⅳ16-3-2 and DC009-1-23 had a higher antagonism and the diameters of inhibiting bacteria circle were 20.5 mm and 15.5 mm. By rescreening these two strains with higher antagonism from fermentation broth, the result showed that their mycelial growth inhibition rates were 89.02% and 80.49%. Biopsy tests showed that the control efficiency of IV 16-3-2 and DC009-1-23 to Rhizoctonia solani reached 54.29% and 45.71%, respectively. According to morphological characteristic and phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequence, the strain Ⅳ16-3-2 was preliminarily identified to be Streptomyces variabilis while the strain DC009-1-23 was identified to be Streptomyces lilaceus.

Rhizoctonia solani Actinomycetes Saline-alkali soils Biological control

2013-09-16

国家自然科学基金资助项目（31260134，30960078）

王蓓，女，硕士研究生，研究方向：微生物拮抗性；E-mail：wangbei0523@126.com

牛世全，男，教授，硕士生导师，研究方向：微生物资源和微生物生态；E-mail：sqniu@nwnu.edu.cn