两种型号的自动免疫组化染色机的应用及体会

张雯静，陈洁，孔静萍

两种型号的自动免疫组化染色机的应用及体会

张雯静，陈洁，孔静萍

目的探讨两种型号的自动免疫组化染色机在病理工作中的应用。方法收集已诊断明确的乳腺癌标本30例和卵巢癌标本10例，选择5种常用的免疫标记，分别用ROCHE公司的BenchMark XT和DAKO公司的Autostainer Link 48自动免疫组化染色机分别进行染色。结果两种型号的自动免疫组化染色机均取得较为满意的染色结果，信号强，结构清晰，定位准确，非特异性染色着色少。结论自动免疫组化染色机标准化程度高，能为临床病理诊断提供更准确的依据。

试剂；抗原修复；一抗；自动免疫组化染色机

临床对病理工作的要求越来越高，病理诊断和方法的标准化尤其显得重要，其中技术规范化是标准化的一个重要方面。自动免疫组化染色机对免疫组化标准化程度的提高起到了一定的推动作用[1]。宁波市病理中心从2011年底引进8台ROCHE公司的BenchMarkXT和DAKO公司的AutostainerLink48自动免疫组化染色机，染色结果较为满意。本文就这两种型号的自动免疫组化染色机的操作及不同点作一探讨。现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料收集病理中心2012年6月至2013年1月期间已诊断明确的乳腺癌标本30例和卵巢癌标本10例，选择雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、人类表皮生长因子受体2（Her-2）、细胞角蛋白广谱（CK-pan）和卵巢癌抗原（CA125）这几种较为常用的免疫标记，ROCHE公司的BenchMark XT自动免疫组化染色机，DAKO公司的AutostainerLink48自动免疫组化染色机，PTLINK脱蜡修复一体机，二抗及DAB显色系统、复染液均为机器自带的成品配套试剂。

1.2 方法标本用10%甲醛进行固定，经自动脱水机进行脱水、透明、浸蜡，石蜡包埋后行组织切片，切片厚度3m，无皱褶和刀痕，同一组织连续切两张切片，各两组，石蜡切片在（60±5）℃恒温箱烤片，时间在40min左右，最长不超过2h，以免破坏组织中的抗原，分别用两张型

号的免疫组化染色机进行染色操作。

1.2.1 BenchMark XT染色机根据一抗及蜡块信息，打印条形码标签，端正贴于切片上，打开仪器将切片按标签朝金属盘中心放置在切片盘上，确保每张切片放稳，固定于4个卡齿之内；将二抗DAB试剂盒、复染液、一抗等试剂瓶放在检测试剂架上，检查加样口是否充满液体，确认仪器装载的AFM试剂桶中有足够多的满足本次运行的试剂量，打开计算机桌面上的Ventana NexES软件，确认信息后，启动电脑程序。染色完成后，取出切片并用洗洁精洗去玻片上的油污，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.2.2 Autostainer Link 48染色机输入信息并打印二维码标签贴于切片上，将切片插入切片架的切片夹上浸泡于PT LINK脱蜡修复一体机进行脱蜡水化抗原修复，完成后移出切片架立即浸入含有0.05%Tween20的缓冲液中至少5 min，将本次运行所需的试剂瓶按瓶口在左，二维码在右放于试剂架上，确认有满足此次运行的试剂量，将切片架置于染色仪中，打开软件进入仪器界面，点击“START”开始染色程序，运行结束后，同样进行脱水、透明、封片步骤。

2 结果

两种型号的自动免疫组化染色机染色均匀，结构清晰，定位准确，无边缘效应，非特异性着色少。ER、PR、Her-2、CK-pan免疫标记染色强度差异不明显（封三彩图9～10），但CA125标记，Bench-MarkXT染色强度高于AutostainerLink 48（封四彩图1）。

3 讨论

自动免疫组化染色机染色结果稳定，可重复性高，为免疫组化标准化提供了有力的条件[2]。两种型号仪器的实验条件及操作方式也有所不同，现分析如下。

3.1 染色程序运行前BenchMark XT注册新试剂是用注册棒接触注册卡上的数据按钮，关联抗体信息及成品配套试剂盒中的试剂信息，使用的标签采用条形码技术，条形码标签需端正贴于玻片上，不能有皱折，标签表面无水分，才能保证仪器正常扫描[3]。用户填充试剂瓶加注一抗时，为保证抗体效价应每次少量灌注，只需能满足此次运行所需的抗体量，试剂瓶管口呈半月形液面，不需要一定的底液（废液）量；每个染色方案默认的试剂加液量均为100l，一台Bench-Mark XT染色机一次可运行的容量为30张切片，开放性试剂架上可以选择应用35种不同的试剂（包括配套试剂盒、一抗等）。Autostainer Link 48定义一个新试剂是用红外线扫描仪扫描试剂瓶口旁的二维码信息，软件自动储存试剂信息。它所使用的是二维码标签，二维码信息密度高，纠错能力强，相对尺寸小，比作为一维码的条形码更具有优势，在程序运行中扫描更快捷[4]。每个试剂瓶按瓶子本身的规格，5 ml试剂瓶和12 ml试剂瓶各有0.6 ml和1.2 ml的底液量，这些试剂量也就是废液量，不能用于本次染色程序，是额外增加的试剂成本。在染色程序运行前，实验人员可根据每张切片上的组织块位置，调整试剂滴加的位置和试剂量，一般一个加样区滴加150 l，如果组织比较大需要二个加样区，每个区域的加样量各为100l。一台Autostainer Link 48染色机一次可运行48张切片，一个工作台可装载两个独立的试剂架，每个试剂架容纳21个试剂瓶，一次运行的数量比BenchMark XT染色机多。

3.2 运行染色程序BenchMarkXT染色机脱蜡、抗原修复、孵育、显色、复染全都在机器内自动完成，染色过程中装有切片的金属盘处于密闭状态，实验人员通过软件监控切片盘的温度、压力，试剂加样等情况。一台仪器从扫描到进入染色程序需要5 min，如试剂装载错误或切片放置不平，在校正后染色机重新扫描程序。切片用PH8.4的EDTA修复，抗原修复温度为99.5℃，一抗孵育温度是37℃，采用Thermopad温控技术，每张切片独立温控，37℃至95℃4min，95℃至37℃7min，提供最佳反应动力学。利用空气涡流混匀技术，保证组织全层覆盖，试剂充分混匀，避免边缘效应和阶梯效应。在染色过程中，每次加样后都会滴加液体封盖膜，保证试剂不被蒸发，提供稳定的染色结果。每次加样前后都有清洗步骤，利用双清洗和喷气清洗，保证洗去之前染色的残留液，减少背景着色。Autostainer Link 48染色机的脱蜡及修复程序是在PT LINK机上完成，其他步骤则是在染色机上完成。PTLINK仪器将稀释比1∶50的PH 9.0 EDAT修复液预热至65℃，费时14min，然后放入切片架后进行脱蜡修复，95℃热浴10～15min，修复结束并冷却至70℃后，移出切片架至缓冲液中至少浸泡5 min后上机。染色机是半敞开式的，便于实验人员更直观的观察切片的染色情况。从扫描开始到进行染色程序需时2 min，试剂瓶放置不正确或缺如，重新装载后，扫描会从上次扫描的最后位接下去继续读取试剂信息，节省了运行时间。染色过程在室温中进行，每次加样前，机械臂中的空气喷嘴泵去除上次试验的试剂并用PBS缓冲液冲洗切片，之后试剂探针滴加试剂。保湿室关闭时，创建一个密封的环境，确保切片在运行中不干燥，防止出现非特异性背景着色。Autostainer Link 48染色机滴加一抗试剂时，只是滴加在实验人员定义的组织在玻片上的位置，如遇到组织体积大，由于没有混匀技术，试剂不能全层覆盖，会出现染色不均的情况（封四彩图2）。

3.3 仪器的清洗、维护BenchMark XT染色机每次运行结束后均应执行清洗循环，每周用热肥皂水、热水、去离子水依次清洁切片盘，定期清洗废液桶，向空桶中加入一定量的的浓缩消毒灭菌液，保持数分钟后排空。用“花王”牌漂白水进行季度保养维护，每染色制片12 500张或每6个月需由专业工程师进行全面维护，以保证仪器发挥其最佳性能[4]。Autostainer Link 48染色机软件从最后一个清洗循环监控染色切片的数量，每完成200张切片，机器自动提示需进行一次清洗循环。为保证染色正常运行，所有的试剂瓶必须保持清洁，应使用无水乙醇冲洗3遍以清除潜在的污染物，每次使用后，用去离子水冲洗切片架，刷去积存的残留盐，每年的维修由专业的DAKO技师完成，基础的预防性维护必须联系当地的DAKO代表进行操作。

总之，使用自动免疫组化染色机缩

短了操作时间，使预实验标准化，提供了灵活的程序，保证染色结果的稳定，可以有效地保证染色的准确性，可重复性及整体染色的一致性[5]，自动免疫组化染色机标准化程度高，能为临床病理诊断提供更准确的依据。

[1]陈芳,李海.全自动免疫组织化学染色技术的应用[J].临床和实验医学杂志,2011, 10（20）:1613-1614.

[2]杨月红,袁静萍,袁修学,等.自动免疫组化仪的使用体会[J].临床与实验病理学杂志,2011,27(3):333-334.

[3]林蓁,田甜.提高全自动免疫组化仪制片质量的相关细节[J].临床与实验病理学杂志，2012,28（6）:700-701.

[4]杨军,刘艳,杜彦蕊.关于二维码的研究和应用[J].应用科技杂志,2002,29（11）:11-13.

[5]罗玉凤,曹金伶,杨春明,等.免疫组化手工操作与机器制片染色比较[J].协和医学杂志,2012,3(1):117-119.

10.3969/j.issn.1671-0800.2014.12.065

R446

A

1671-0800(2014)12-1572-03

315031 宁波，宁波市临床病理诊断中心

张雯静，Email：tq05poy@ 163.com