改良骨髓脱钙液对免疫组化染色结果的影响

夏朝霞

改良骨髓脱钙液对免疫组化染色结果的影响

夏朝霞

目的探讨酸脱钙液对骨髓活检组织免疫组化染色的影响。方法对445例骨髓活检组织经混合酸脱钙及EDTA双重脱钙固定、免疫组化染色。结果组织结构、细胞形态清晰完整，免疫组化染色定位准确、背景清晰。结论混合脱钙液与EDTA联合应用有助于免疫组化染色，是骨髓活检病理诊断的有效方法。

骨髓；脱钙；脱钙液；免疫组织化学

骨髓活检（BMB）技术在骨髓制片诊断中越来越具有优越性，但骨髓组织含有大量矿化物质，给制片造成很大难度，而且骨髓本是各种细胞的发源地，细胞种类和形态极为丰富仅有常规制片诊断难度极大，因而必须结合免疫组化染

色以利于准确诊断。而传统脱钙液在脱钙的同时往往造成组织细胞形态改变及免疫抗原的破坏、丢失影响免疫组化结果[1]。故而笔者结合骨髓组织学特点调整脱钙液配方及方法，以改善制片质量及免疫表型的表达。报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料选取宁波病理中心2011年7月至2013年4月骨髓活检标本445例。1.2试剂（1）脱钙液A：4%～5%甲酸20ml；4%甲醛40ml；冰乙酸5ml；1%浓盐酸15 ml；氧化铝6 g，加0.9%氯化钠注射液至400 ml。（2）脱钙固定液B：pH 8.0的乙二胺四乙酸（EDTA）溶液用1molHCL调至pH 7.2，再加入4%甲醛15 ml。（3）免疫组化试剂：一抗及二抗均购自DAKO公司。

1.3 方法（1）组织脱钙：组织至脱钙液A中3h，冲洗1h后在进入脱钙固定液B 中2h。取出后与常规小组织一起脱水、透明、浸蜡，常规包埋。（2）免疫组化染色：①切片脱蜡至水。②按抗体需要修复（酶消化或热修复），PBS冲洗2 min×3。③3% H2O2室温孵育15～20 min，PBS冲洗2 min×3。④滴加一抗37℃孵育60 min，PBS冲洗2min×3。⑤滴加二抗37℃孵育15 min，PBS冲洗2 min×3。⑥DAB镜下显色，苏木素复染，脱水，封片。

2 结果

骨髓组织脱钙效果良好，组织学结构和细胞轮廓清晰完整。切片免疫组化染色定位准确，染色背景清晰，无非特异性着色。见封四彩图3～4。

3 讨论

BMB在骨髓增生性肿瘤（MPN）中的原发性骨髓纤维化、原发性血小板增多症、慢性嗜酸粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病急性变、肥大细胞增生症及骨髓转移瘤等的诊断与鉴别诊断中尤其具有独到的优势，平均符合率约为94%[1]。而BMB免疫组化辅助诊断使得骨髓病理诊断及临床预后更具积极意义。但骨髓酸脱钙处理或多或少地降低了组织免疫组化染色的敏感性[2]。如何使脱钙液既能有效脱钙制片又最大程度的保留抗原的完整性，利于免疫组化染色是骨髓制片技术的研究方向。

脱钙的目的是脱去骨基质中的羟基磷灰石（HAP）同时不破坏组织细胞形态，不损伤细胞大分子物质丢失抗原。传统脱钙液如硝酸，属强酸在脱钙过程中产生二氧化碳气泡可引起组织变形，而且组织酸化易使HE染色时细胞核染色欠佳[3]。本方法选用混合酸配方及EDTA甲醛液双重脱钙、双重固定。从而在短时间内使组织脱钙完全快速、组织固定充分、抗原保存良好。本文中的脱钙液A为复合脱钙液：4%～5%甲酸（CH2O2）为有机酸又称蚁酸为一种弱酸。因其性能相对温和，作用缓慢适用于免疫组化染色[4]。浓盐酸（CHL）是一种强酸为无机酸，具极强挥发性。可加速脱钙，但可使组织略收缩，影响核染色。但有报道显示1%盐酸短时间浸泡对组织细胞形态和大部分抗原免疫组化染色效果影响不大，背景染色较少[2]。故本文中选用1%盐酸，减少组织收缩和对染色的影响。4%甲醛（HCHO）为强还原剂，是一种良好的固定剂，在微碱性时还原性更强。0.9%氯化钠为等渗溶液，pH为中性。加入0.9%氯化钠不仅可以平衡酸溶液，而且能起到水化甲酸、甲醛的作用，使溶液更具亲水性，渗透性更强。而HAP属极性分子具有亲水性，被水化的甲酸、甲醛能更好地与HAP反应。

EDTA有机盐类为重要的络合剂，而且EDTA可消除微量金属导致的酶催化反应中的抑制作用，在蛋白质工程及试验中可在不影响蛋白质功能的情况下去除干扰离子。故而EDTA为一种理想的利于免疫组化染色的脱钙液[5]。但EDTA性质温和，对组织渗透性差，脱钙时间过长影响诊断及治疗[6]。本文使用EDTA再次脱钙固定，既进一步完善脱钙固定，减少组织固定不佳抗原破坏和丢失，而造成抗原移位，抗体特异性差，浓度不够或严重交叉反应[7]。又可减少酸对组织的损伤，最大程度的避免由此造成的假阳性或假阴性表达。减少人为因素的干扰才能获得理想的实验室数据，最准确的病理诊断。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2014.08.047

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