中药野艾挥发物抗菌活性与化学成分分离鉴定研究

郑 涛 程再功 朱 钧

1.泰州职业技术学院，江苏泰州225300；2.扬子江药业集团有限公司，江苏泰州225321；3.江苏莱芙时代生物科技有限公司，江苏泰州225309

中药野艾挥发物抗菌活性与化学成分分离鉴定研究

郑 涛1程再功2朱 钧3

1.泰州职业技术学院，江苏泰州225300；2.扬子江药业集团有限公司，江苏泰州225321；3.江苏莱芙时代生物科技有限公司，江苏泰州225309

目的对中药野艾的药用价值进行研究，主要对其挥发物进行抑菌活性研究及化学成分进行分离鉴定，进而为野艾的药用价值寻找依据。方法①采用超临界二氧化碳（CO2）萃取法提取野艾的挥发油，然后测定挥发油对于革兰阳性菌、革兰阴性菌和真菌的杀菌抑制作用；②使用气相色谱-质谱联用仪对挥发油进行化学成分分离鉴定。结果①挥发油对革兰阳性菌杀菌效果较好，对真菌的效果一般，对3种革兰阴性菌无杀菌活性；②分离鉴定出39种成分，野艾挥发油主要成分是蒿酮（15.47%）、蒿醇（9.55%）、顺式丁香烯（8.85%）、艾醇（7.28%）和桉叶素（6.78%）等。结论挥发油对所测试的菌落有很好抑制作用，对革兰阳性菌有很好的杀菌作用。

野艾；挥发油；化学成分；抗菌活性

野艾属于菊科蒿属草本植物，俗名苦艾、野艾蒿等，是我国的传统中药。艾草性味苦、辛、温，入脾、肝、肾。《本草纲目》记载：艾以叶入药，性温、味苦、无毒、纯阳之性、通十二经、具回阳、理气血、逐湿寒、止血安胎等功效，亦常用于针灸。故又被称为“医草”，现在台湾正流行的“药草浴”，大多就是选用艾草。关于艾叶的性能，《本草》载：“艾叶能灸百病。”《本草从新》说：“艾叶苦辛，生温，熟热，纯阳之性，能回垂绝之阳，通十二经，走三阴，理气血，逐寒湿，暖子宫，……以之灸火，能透诸经而除百病。”说明用艾叶作施灸材料，有通经活络、祛除阴寒、消肿散结、回阳救逆等作用。现代药理发现，艾叶挥发油含量多，1，8-桉叶素（占50%以上），其他有α-侧柏酮、倍半萜烯醇及其酯。风干叶含矿物质10.13%，脂肪2.59%，蛋白质25.85%，以及维生素A、B1、B2、C等。灸用艾叶，一般以越陈越好，故有“七年之病，求三年之艾”（《孟子》）的说法。全草有调经止血﹑安胎止崩﹑散寒除湿之效。治月经不调﹑经痛腹痛﹑流产﹑子宫出血，根治风湿性关节炎﹑头风﹑月内风等。因它可削冰令圆，又可炙百病，为医家最常用之药。现代实验研究证明，艾叶具有抗菌及抗病毒作用；平喘、镇咳及祛痰作用；止血及抗凝血作用；镇静及抗过敏作用；护肝利胆作用等。艾草可作“艾叶茶”、“艾叶汤”、“艾叶粥”等食谱，以增强人体对疾病的抵抗能力。艾草具有一种特殊的香味，这特殊的香味具有驱蚊虫的功效，所以，古人常在门前挂艾草，一来用于避邪，二来用于赶走蚊虫，因此，对于野艾成分的研究尤其必要。本研究对野艾的挥发油进行提取分离、成分鉴定，并研究其对微生物的杀灭抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料

原材料野艾购于深圳市福田区中医院，产地广东，超临界萃取装置、气相色谱-质谱联用仪等均为国内研发制作。试验所用蒸馏水均采用自动双重纯水蒸馏器制作。菌株均来自武汉大学的菌种保藏中心，实验采用牛肉汁蛋白胨培养基（酵母浸膏1 g，牛肉浸膏4 g，蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，琼脂15 g，水1 L，pH＝7.0，121℃灭菌30 min）培养。

1.2 方法

1.2.1 挥发油提取

采用超临界CO2萃取法进行挥发油提取[1-2]：①将收集的野艾地上部分洗净阴干切碎，称重为8.9 kg，装入萃取装置；②萃取装置温度设置为35℃，通入CO2，排出装置中的空气；③打开压缩机，调节仪器内部压强保持在16 MPa，调节CO2出口阀，保存20 kg/h；持续80 min，打开分离器，取出萃取物；④关闭萃取装置，放空CO2，取出挥发油粗制提取物，然后放入2倍的无水乙醇，搅拌均匀，静止24 h；⑤真空抽滤，再除去蜡质沉淀物，最后将滤液在30°回收乙醇，得到精制野艾挥发油。

1.2.2 抑菌圈测定

试验对野艾挥发油的抑菌效果测定使用的是滤纸片琼脂平板扩散法[3]。首先，在三个固体平板均匀涂上牛肉汁蛋白胨培养液；其次，取已灭菌的滤纸片（7 mm）粘取约15 μL已稀释好的挥发油样品置于平板上，每个菌种取6个平行组；最后，放入培养箱中培养，细菌组温度为36℃，24 h，真菌组温度为27℃，48 h，测算菌落直径3次求取平均值，并以左旋氧氟沙星为对照。

1.2.3 最低杀菌浓度（MIC）和最低抑菌浓度（MBC）的测定

采用稀释法对MCI和MBC进行测定[4]。在96孔的平板上涂上液体培养基、接种菌落、再加入已稀释好的各浓度挥发油样品。放入培养箱中培养，细菌组温度为36℃，24 h，真菌组温度为27℃，48 h，后观察，每个菌种的每个挥发油样品相同稀释度的实验各三组，重复两次。MIC的确定标准[5]：肉眼无法观察到培养基内培养物浑浊的样品为最低抑菌浓度。MBC的确定标准：首先是取出培养后无浑浊的平板再培养，以再培养后平板无菌落生成为最低样品的抑制浓度。并以左旋氧氟沙星为对照。

1.2.4 使用质谱联用仪对野艾挥发油进行化学成分分离鉴定

首先，将挥发油样品以1∶5的比例溶于乙酸乙酯，摇匀，分流进样。鉴定分以下两个部分：

1.2.4.1 色谱条件色谱柱（25 m×0.25 mm），柱温：前两分钟保持45℃，再以5℃每分钟的速度提高至100℃，保持2 min，再以10℃每分钟提高到220℃，进样量：0.5 μL，流速：1 mL/min，载气：He，分流比：30。采用归一化法计算其相对的百分比含量。

1.2.4.2 质谱条件进物口温度220℃，EL电离方式，电离电压为70 EV，离子源温度为330℃，扫描范围为35～350 amu，各组成成分分子式通过NIST进行检索。1.3统计学方法

采用统计软件SPSS 15.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 野艾挥发油结果和化学成分GC-MS分析

经气相色谱分离出挥发油中的39种成分，再经质谱图NIST检索确认，再用面积归一化法，分析出其各自的相对含量，其余成分因各种原因未能确认。表1结果显示，野艾挥发油主要的五种成分分别是蒿酮（15.52%）、蒿醇（9.63%）、顺式丁香烯（8.71%）、艾醇（7.37%）和桉叶素（6.47%）等。

表1 野艾挥发油GC-MS分析结果和化学成分

2.2 野艾挥发油对三类菌的抗菌效果

对革兰阳性菌的抗菌效果相对较好，对真菌的效果一般，对革兰阴性菌无效。具体见表2。

3 讨论

试验对野艾挥发油的化学成分研究采用了气-质联用的分析方法，首先通过使用超临界CO2萃取法对野艾挥发油进行分类提纯鉴定[6]，其次再使用气相色谱对挥发油进行成分分离鉴定，查出挥发油中所含有的各化学成分组成，再利用归一法测算挥发油中各化学成分的相对百分含量，最后再通过质谱联用仪进行确定，采用NIST计算机分子库进行自动检索，确定挥发油中的各种化学成分及其含量[7]。

表2 野艾挥发油对各种微生物的抗菌活性

试验中对于野艾的杀菌抑菌研究也表明野艾挥发油对测试菌种有较强的抑制和杀灭作用，尤其是对革兰阳性菌的杀菌活性很强[8]。在过往的研究中也曾有过类似的报道[9-11]，蒿酮、蒿醇和桉叶素对革兰阳性菌有很强的的杀灭作用，对部分真菌和革兰阴性菌也有抑制作用，在这种也可以看出这三种物质是野艾抗菌的物质基础，野艾挥发油对几种细菌的生长抑制作用会随着挥发油浓度的提高而加强[12-15]。

本文对挥发油抗菌活性的研究还利用了挥发油中芳香类化合物包括柠檬烯、蒎烯等的抗菌作用，尤其是萜类的化合物。有数据显示[4]，芳香族化合物（例如柠檬烯）的特点是：其一，具有较强的香气；其二，具有较好的抗菌效果；其三，具有较高的药物成分；其四，具有较大的生物活性。因此可将其作为制作生态抗病毒杀菌剂的合理材料。

[1]江贵波，曾任森.艾的挥发性物质化感作用研究[J].生态科学，2012，（2）：124-125.

[2]戴小军.野艾组分对幽门螺杆菌的体外抑菌作用[J].中国林业科学研究所，2011，（12）：236-237.

[3]熊子文.野艾蒿的华夏组成及抗氧化、抑菌活性研究[J].中药新药与临床药理，2010，（1）：367-368.

[4]孙红祥.一些中药及其挥发性成分抗霉菌活性研究[J].中国中药杂志，2011，26（2）：99-102.

[5]谢强敏，胡志明.多种植物挥发油成分分析和抗菌活性及岩白菜素的研究[J].中国现代应用药学杂志，2010，16（4）：125-126.

[6]丁海新.旋覆花抑菌活性成分的研究[D].西安：西北农林科技大学，2004.

[7]江红轲.艾灸足三里、关元对运动训练大鼠血液生化指标、激素水平及自由基代谢影响的实验研究[D].西安：陕西师范大学，2005.

[8]王新卷.安慰艾炷的研制及其安慰效果的临床评价[D].北京：北京中医药大学，2005.

[9]Mou SM，Wei JP，Liu F，et al.A Comparative Study of Supervised Learning as Applied to Acronym Expansion in Clinical Repo[J].Sichuan，2008，（11）：124-125.

[10]Army Acupuncture in the Inpatient Acute Care Setting. A Pragmatic Randomized Control Trial[J].Rinshobyori，2011，46（3）：277-282.

[11]Salem MA.Advances in Vascular Cognitive Impairment diabetesmellitus[J].Pediatr Diabetes，2012，3（1）：37-41.

[12]Zhu P，Xie CHG，Nigreen，et al.Cortical lesions and cognitive impairment in multiple sclerosis[J].Chinese Journal of traditional Chinese Medicine，2010，（2）：225-226.

[13]Stier W.Middle cerebral artery occlusion products-involvement of N-methyl-D-aspartate[J].Journal of Sport Management，2010，2（1）：60-97.

[14]张淑凤，张兆林，陈俊荣，等.依诺沙星与铈配合物的制备及其抗菌活性[J].中国医药导刊，2011，13（1）：172-173.

[15]左雪灿，楚艳玲.643株临床常见病原菌分布及耐药性分析[J].中国医药导刊，2010，12（7）：1217-1218.

Activity and chemical separation appraisal research of traditional Chinese medicine mugwort volatiles antibacterial

ZHENG Tao1CHENG Zaigong2ZHU Jun3
1.Taizhou Polytechnic College,Jiangsu Province,Taizhou225300,China;2.Yangtze River Pharmaceutical Group Co., Ltd.,Jiangsu Province,Taizhou225321,China;3.Jiangsu Laifu Era Biotechnology Co.,Ltd.,Jiangsu Province,Taizhou 225309,China

Objective To study medicinal value of TCM mugwort,mainly refer to the volatiles study of antibacterial activity and chemical composition of isolation,identification and basis for mugwort medicinal value.Methods①Supercritical fluid extraction method was used to extract the volatile oil of mugwort,and determination of volatile oil in gram-positive bacteria and gram-negative bacteria and fungi bactericidal inhibitory effect;②gas chromatographymass spectrometry instrument was used to identify chemical separation of the volatile oil.Results①The essential oil of gram positive bacteria sterilization effect was good,but to the fungus,the effect was general,and had no bactericidal activity for the three kinds of gram-negative bacteria;②39 species composition were separated and identified,mugwort naphtha were mostly artemisia alcohol of 15.47%,artemisia ketone of 9.55%,cis clove ene of 8.85%,ai alcohol of 7.28%and eucalyptus evvh of 6.78%,etc..Conclusion The essential oil has a good inhibitory effect on the colony test, and has a good bactericidal effect on gram-positive bacteria.

Wild wormwood;Volatile oil;Chemical composition;Antimicrobial activity

R284.2

A

1673-7210（2014）01（a）-0097-03

2013-08-22本文编辑：卫轲）

江苏省国际科技合作计划项目（编号BZ2010039）。

郑涛（1981.10-），男，硕士研究生；研究方向：天然药物化学。