白念珠菌诱导不同来源树突状细胞分化成熟能力的比较

宣晓梅 李英涛 刘 静 李艳佳 刘丽娟

白念珠菌诱导不同来源树突状细胞分化成熟能力的比较

宣晓梅 李英涛 刘 静 李艳佳 刘丽娟

目的: 比较白念珠菌诱导人外周血单核细胞源树突状细胞(dendritic cells,DCs)和小鼠骨髓源DCs两者分化成熟能力的差异。方法: 体外培养正常人外周血单核细胞源DCs和小鼠骨髓源DCs,随机分为空白组、无菌盐水对照组和实验组。光镜下观察DCs细胞的形态变化。结果: 小鼠骨髓源与人外周血单核细胞源DCs CD80、CD86及IL－12分泌量与加入的白念珠菌悬液剂量成正相关,小鼠骨髓源DCs在各组间增加幅度明显高于人外周血单核细胞源DCs(均P＜0.05)；白念珠菌刺激前后小鼠骨髓源DCs形态变化程度较明显,而人外周血DCs形态未见明显变化。结论: 白念珠菌可促进人外周血单核细胞源DCs和小鼠骨髓源DCs的成熟；在相同条件下,白念珠菌更易促进小鼠骨髓源DCs分化。

树突状细胞； 白念珠菌

白念珠菌是自然界最常见的致病性真菌之一,是人类重要的条件致病菌之一,可引起女性外阴阴道念珠菌病,也可以因各种介入性诊疗、抗菌素长期大量应用、机体免疫功能低下或缺陷引起致命性的系统性感染。随着人类抗真菌药物的广泛应用,白念珠菌对各种抗真菌药物的耐药性逐年增加,1－3给临床白念珠菌感染的治疗带来一定困难,从免疫学角度出发的治疗方法也许会成为一个崭新领域。树突状细胞(dendritic cells,DCs)是最重要的抗原提呈细胞,可通过产生细胞因子和表达表面分子等,诱导T细胞向不同类型Th细胞分化,在T细胞免疫中起重要的调节作用,是许多抗感染免疫的起点和调节点。本实验通过在人外周血单核细胞源DCs及小鼠骨髓源DCs培养过程中,加入标准白念珠菌成份溶液刺激,观察两者刺激前后形态变化程度、表面分子及细胞因子增加幅度的差别,比较白念珠菌诱导两者致敏效果及分化成熟的能力是否存在差别。

1 材料与方法

1.1 材料 正常人外周血(购自河北省血液中心)、试验菌株白念珠菌标准株ATCC10231(河北医科大学免疫教研室提供)、重组人GM－CSF和IL－4(美国PEPRO TECH Asia公司)、PE抗人CD80、CD86抗体(美国Baker Catalog公司)。试验动物C57BL/6J 6～8周龄小鼠(河北医科大学第一医院中心实验室)、rmGM－CSF、rm IL－4(美国PeproTech公司)、PE抗鼠CD80、CD86荧光抗体(美国eBioscience公司)。

1.2 方法

1.2.1 白念珠菌溶液的制备 将标准菌株ATCC10-231置于沙保氏培养基上37℃培养48 h,挑取适量菌落用无菌生理盐水洗3遍,借助微量天秤配成0.1 mg/mL无菌生理盐水悬液,再用超声波破碎仪将其彻底粉碎备用。

1.2.2 人外周血树突状细胞的分离及诱导 取正常人外周血10 mL,肝素抗凝后,加入10 mL磷酸盐缓冲液(简称PBS)稀释混匀,置淋巴细胞分离液上, 2000 r/min,离心30 min。吸取白膜层细胞,2000 r/ min,离心20 min,去上清,加入PBS 5 mL,吹打均匀,再以1000 r/min,离心8 min,获得单核细胞。将单核细胞加入含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液5mL中吹打均匀,置于6孔培养板中,浓度调整为1× 106个/mL,37℃5%CO2培养箱中贴壁3 h,去除上清及悬浮细胞,每孔加入PRMI 1640完全培养基3 mL,GM－CSF(50 ng/m L)和IL－4(10 ng/mL)各150 μL,继续培养,隔天换液至第7 d。

1.2.3 小鼠骨髓源树突状细胞的分离及诱导 断颈处死C57BL/6J小鼠,用剪刀和齿镊游离皮肤后,自踝关节及髋关节处获取股骨和胫骨,置于75%的乙醇中浸泡20min、PBS冲洗3遍。剪去股骨和胫骨两端完全暴露骨髓腔,用盛有7 mL PBS的10 mL注射器将骨髓细胞冲入培养皿中。将获得的骨髓细胞通过筛网去除颗粒后收集于离心管,1500 r/min,离心5 min,弃上清。加红细胞裂解液5 mL裂解2 min,加5 mL PBS终止反应,1500 r/min,离心5 min,弃上清,5 mL PBS冲洗2次,离心去上清,获得骨髓单细胞悬液。将其置于6孔培养板中,调整细胞浓度至1×106/L,加RPMI 1640完全培养基2 m L(内含10～20 ng/mL小鼠重组GM－CSF,1 ng/m L小鼠重组IL－4),37℃5%CO290%湿度培养箱中培养。24 h后水平晃动培养板20次,全量换液去除未贴壁细胞。第3～7 d隔天半量换液。

1.2.4 白念珠菌作用于树突状细胞 培养第7 d,人外周血DCs和小鼠骨髓源DCs均随机分为实验前组20孔、对照组20孔和实验组60孔。刺激前组直接收集DCs及培养上清,调整细胞浓度为1×106个/mL用于流式检测。实验组再分为3组每组20孔,分别加入0.5m L、1 mL、1.5 mL配好的白念珠菌溶液,对照组加入同等剂量无菌生理盐水,继续培养12 h。

1.2.5 细胞收集 吹打六孔板,使所有的细胞悬浮,分别收集各组细胞及培养上清,用于下一步检测。

1.2.6 细胞形态的观察 在培养的8 d中,通过显微镜观察各组细胞的形态及生长状况,注意观察加入白念珠菌溶液前后及各剂量组间DCs的形态是否有差异；观察人DCs实验组和小鼠DCs实验组细胞形态变化程度有无差别,并进行拍照。

1.2.7 流式细胞仪测定DCs表面分子CD80、CD86的表达 将各组细胞用生理盐水稀释后,滤去细胞团块,收集单细胞悬液,并将细胞浓度调整为1×106个/ m L。人外周血DCs分别加入PE标记的鼠抗人CD80和CD86抗体,小鼠骨髓源DCs加入PE抗鼠CD80、CD86荧光抗体,避光室温孵育30 min,离心弃上清,去除游离的荧光抗体,PBS洗涤细胞2次,再用PBS悬浮细胞,置于流式细胞仪测定CD80和CD86。

1.2.8 ELISA法检测细胞因子IL－12 各组培养上清液采用双抗夹心ELISA法测定IL－12含量,步骤按试剂盒说明书操作。

1.2.9 统计学方法 实验结果以¯x±s表示。用SPSS 13.0软件包进行单因素方差分析及配对资料秩和检验,检验水准为0.05。

2 结果

2.1 DCs形态观察 通过显微镜观察发现,人外周血DCs于培养第7 d,细胞逐渐从聚集状态变为分散状态,细胞形态不规则,表面有部分毛刺状突起,分化成非成熟DCs。加入不同剂量白念珠菌溶液刺激后,对照组和各剂量实验组与刺激前组细胞形态无明显区别(图1)。

由小鼠骨髓分离DCs于培养的第7 d,部分细胞有细长突起形成,偶见带有明显刺突的DCs。加入不同剂量白念珠菌溶液刺激后,对照组与刺激前无明显变化,实验组细胞刺突增多、加长,形态更趋于成熟,各剂量实验组间DCs形态无明显区别(图2)。

2.2 DCs表面分子的表达 人外周血DCs对照组加入无菌生理盐水刺激后,CD80、CD86表达量与刺激前组比较无显著性差异(tCD80＝0.13、tCD86＝0.67,P＞0.05)。0.5、1、1.5 mL标准菌成分溶液刺激实验组, CD80、CD86表达量与白念珠菌悬液剂量成正相关(FCD80＝4579.58、FCD86＝6041.48,均P＜0.05)(图3,表1)。

小鼠骨髓DCs对照组加入无菌生理盐水刺激后, CD80、CD86表达量与刺激前组比较也无显著性差异(tCD80＝0.09、tCD86＝0.52,P＞0.05)。刺激前组及加入0.5、1、1.5 mL标准菌成分溶液刺激实验组,CD80、CD86表达量与白念珠菌悬液剂量成正相关(FCD80＝38682.09、FCD86＝1705.50,均P＜0.05)(图4,表1)。

0.5 m L组与刺激前比较、1 mL组与0.5 mL组比较、1.5 m L组与1 mL组比较人外周血来源DCs表面分子CD80增加幅度小于小鼠骨髓源DCs(T＝189,T＝200,T＝210,均P＜0.05),CD86增加幅度亦小于小鼠骨髓源DCs(T＝204,T＝196,T＝210,均P＜0.05) (表2)。

图1 倒置显微镜下各组人外周血单核细胞源DCs形态(×200)

图2 荧光显微镜下各组小鼠骨髓源DCs形态(×200)

图3 流式细胞仪检测各组人外周血单核细胞源DCs表面CD80、CD86

图4 流式细胞仪检测各组小鼠骨髓源DCs表面CD80、CD86

2.3 细胞因子IL－12测定 人外周血DCs对照组加入无菌生理盐水刺激后,IL－12分泌量与刺激前组比较无显著性差异(tIL－12＝0.64,P＞0.05)；刺激前组及加入0.5、1、1.5 mL标准菌成分溶液刺激实验组中,各组IL－12分泌量与白念珠菌成份溶液剂量成正相关(FIL－12＝133074.97,P＜0.05),见表1。

表1 流式细胞仪检测CD80和CD86、ELISA法检测IL－12结果

小鼠骨髓源DCs对照组加入无菌生理盐水刺激后,IL－12分泌量与刺激前组比较无显著性差异(tIL－12＝0.44,P＞0.05)；刺激前组及加入0.5、1、1.5 mL标准菌成分溶液刺激中,各组IL－12与白念珠菌成分溶液剂量成正相关(FIL－12＝1285036.14,P＜0.05),见表1。

0.5 m L组与刺激前比较、1 mL组与0.5 m L组比较、1.5mL组与1mL组比较IL－12分泌量,人外周血来源DCs增加幅度小于小鼠骨髓源DCs(T＝185,T＝210,T＝207,均P＜0.05),见表2。

表2 两种来源DCs各组之间CD80和CD86及IL－12差值

3 讨论

DCs源于体内的多能造血干细胞,可分为髓系来源和淋巴系来源两大类,其广泛存在于淋巴、非淋巴组织及体液中,具有摄取、处理、呈递抗原给T细胞使其活化并产生影响天然及获得性免疫应答相关细胞因子的功能,是启动和维持免疫系统发挥正常功能的重要成员之一。树突状细胞作为机体抵抗外界病原体入侵的第一道防线中的重要成员,时刻监视着机体环境中的各种外来因子,是针对包括细菌、真菌等成分在内的各种病原体引起免疫应答的主要调节者。4,5但正常情况下,机体内绝大多数DCs均处于非成熟状态,虽具有一定的抗原加工和处理能力,但表面缺乏或低表达MHC分子和表面分子(如CD80、CD86等),仅分泌少量细胞因子(如IL－12等)。只有在外来抗原作用下,才分化为成熟DCs,高水平表达表面分子CD80、CD86及增加IL－12分泌等,继而激活T细胞,启动各种免疫应答反应。6

本实验将相同剂量的粉碎后白念珠菌加入人类外周血单核细胞源DCs和小鼠骨髓源DCs培养皿中,观察作为外界抗原物质的白念珠菌对两者致敏效果是否存在差别,即促进两者成熟的能力是否存在差别。结果表明,粉碎后白念珠菌对小鼠骨髓源DCs细胞形态、表面分子及细胞因子的影响均大于对人类外周血单核细胞源DCs,即白念珠菌更易促进小鼠骨髓源DCs的分化成熟。为了排除生理盐水对实验结果的影响,我们用生理盐水作对照,结果显示生理盐水对两类树突状细胞分化成熟均无促进作用,与以往研究结果一致。7以往报道相关抗原致敏DCs已经在人类某些难治性疾病如病毒感染、肿瘤等治疗中起到一定的积极作用,8－10白念珠菌致敏树突状细胞在各类动物模型包括小鼠模型中获得的数据和经验能否为我们人类提供参考,还需我们进一步细致深入的研究。

1尚元元,喻楠,贾伟,等.2007～2008年医院真菌感染病原菌分布与耐药性分析.中国皮肤性病学杂志,2010,24(1):35－37.

2 Basma R,Barada G,Ojaimi N,et al.Susceptibility of Candida albicana to common and novel antifungal drugs,and relationship between themating type locus and resistance,in Lebanese hospital isolates.Mycoses,2009,52(2):141－148.

3Sidrim JJ,Maia DC,Brilhante RS,etal.Candida species isolated from the gastrointestinal tract of cockatiels(Nymphicus bollandicus):In vitro antifungal susceptibility profile and phospholipase activity.VetMicrobiol,2010,145(3－4):324－328.

4樊超,涂亚庭.树突状细胞分型进展与抗白念珠菌特异性免疫.华中医学杂志,2004,28(4):275－276.

5刘秀红,付萍,邓丹琪.树突状细胞与白念珠菌感染的研究进展.医学综述,2008,14(23):3574－3576.

6杨文博,赵堃.树突状细胞的研究进展.医学综述,2011,17 (15):2279－2281.

7宣晓梅,张瑞君,李艳佳,等.白念珠菌对正常人外周血树突状细胞表面分子的影响.中国皮肤性病学杂志,2009,23(6): 324－327.

8石永进,任汉云,岑溪南,等.树突状细胞靶向捕获乳腺癌细胞后诱发的细胞免疫应答.中华肿瘤杂志,2008,30(2):107－111.

9程建新,马静,宋文惠.树突状细胞疫苗诱导抗子宫内膜癌细胞毒性反应的体外研究.中华妇产科杂志,2009,44(6):457－459.

10查树伟,查佶.树突状细胞疫苗治疗人类免疫缺陷病毒感染的研究进展.国际免疫学杂志,2010,33(3):209－212.

(收稿:2013－07－10 修回:2013－09－09)

Com parison of the effects of Candida albicans on them aturation of the dend ritic cells from the different sources

XUAN Xiao-mei,LIYing-tao,LIU Jing,et al.Department ofDermatology and Venereology,The FirstHospital ofHebeiMedical University,Shijiazhuang,050031

Objective:To compare the effects of Candida albicans on the maturation of dendritic cells (DCs)derived from bonemarrow ofmouse and the peripheral blood monocyte of human.Methods:The two types of DCswere obtained by culture in vitro.The cellswere randomly divided into blank control group,normal saline solution group and experimental group.Themorphological changes of the cellswere observed under themicroscope.Results:The amountof CD80,CD86 and IL－12 secreted by DCs derived from bonemarrow ofmouse and the peripheral blood monocytes of human was positively correlated with the added amount of supernate of cultured Candida albicans.The secreted amount of CD80,CD86 and IL－12 was higher in DCs groups than in groups of peripheral blood monocytes of human(P＜0.05).Themorphological changeswere observed in DCs groups,butwasnot in the groups of peripheral blood monocytes of human.Conclusion:Candida albicans can enhance thematuration of the DCs derived from themouse and human,especially for the former in the same condition.

dendritic cells；Candida albicans

河北医科大学第一医院皮肤科,石家庄,050031