Sulfiredoxin-1通过调节peroxiredoxins表达提高大鼠星形胶质细胞抗氧化作用

周 杨，周云川，巫静娴，喻姗姗，赵 涌

(重庆医科大学基础医学院病理学教研室分子医学与肿瘤研究中心，重庆400016)

Sulfiredoxin-1(Srxn1)是内源性的小分子抗氧化蛋白，Srxn1 在组织细胞中具有抗氧化、抗凋亡和抗炎性反应等保护作用，但具体的机制仍不清楚。在低水平H2O2刺激下，缺少Srxn1 功能的细胞，会导致其氧化还原平衡失调及凋亡［1］。吸烟人群易患COPD，同时患者肺组织内Srxn1 的表达极低，可能与吸烟打破患者肺内氧化/抗氧化平衡系统有关［2］。Peroxiredoxins(Prdxs)属于新的抗氧化蛋白超家族，它包含PrdxⅠ～PrdxⅣ，其中PrdxI ～Ⅳ是最主要抗氧化亚型。其在机体的抗氧化防御系统中有着至关重要的作用［3］。Srxn1 作为抗氧化因子能通过催化过氧化的Prdxs，使其重新恢复抗氧化功能。本研究旨在探讨星形胶质细胞氧化应激损伤过程中Srxn1 对Prdxs 活性的调控作用，为脑组织缺血后过氧化应激损伤保护提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

新生SD 大鼠［重庆医科大学、SPF 级、动物合格证号SCXY(渝)20020003］、Srxn1 干扰慢病毒载体与阴性载体(上海吉玛制药技术有限公司)、DMEM/F12 和FBS(Gibco 公司)、H2O2(Sigma 公司)、LDH 和SOD(南京建成公司)、RNAiso Plus、RT-PCR 试剂盒、SYBR® Premix Ex Taq® (TaKaRa公司)、兔抗-GFAP 多克隆抗体(Santa Cruz 公司)、兔抗-Srxn1 多克隆抗体(北京博奥森公司)、兔抗-PrdxI-Ⅳ和兔抗Prdx-SO2/3H(Abcam 公司)。

1.2 星形胶质细胞的原代培养及纯度鉴定

提取大脑皮质细胞，进行星形胶质细胞原代培养。GFAP 免疫组化染色鉴定星形胶质细胞纯化率。0.01 mol/L PBS 快速漂洗待鉴定细胞，并用4%多聚甲醛固定30 min。用0.01 mol/L PBS 再次漂洗，5 min × 3 次。滴加适量封闭血清，湿盒，37 ℃，30 min，勿洗，滴加一抗GFAP(1∶50)，4 ℃湿盒过夜。0.01 mol/L PBS 漂洗，5 min ×3 次，滴加荧光二抗Alexa Fluor 594 (1∶100)，湿盒，37 ℃，30 min，PBS 清洗，避光加入Hoechst 33342 工作液标记所有细胞核，室温作用20 min，PBS 清洗，甘油封片，荧光显微镜下发光。Hoechst 33342 染色显示细胞核并代表细胞总数，随机选取4 个高倍视野，观察GFAP 阳性率，并可以同时观察细胞的慢病毒转染效率。

1.3 星形胶质细胞的转染

根据前期实验结果，由上海吉玛制药技术有限公司设计、构建shRNA-Srxn1-LV3 干扰的慢病毒载体片段，Sh-RNA 序列为5'-CATCCACACCAGACTTG CAGT-3'，阴性对照序列为5'-TTCTCCGAACGTGTC ACGT-3'。将Sh-RNAs 按照说明书转染至星形胶质细胞中，并在荧光显微镜下观察其转染效率。

1.4 H2O2 星形胶质细胞模型的建立

1)用DMEM/F12 完全培养液将H2O2母液稀释至浓度为10－3mol/L。2)加入稀释后H2O2至需处理的星形胶质细胞中，并加入适量的DMEM/F12 完全培养液使其浓度为100 μmol/L。移至37 ℃、5%CO2孵箱内继续培养。3)6 h 后即可进行后续试验。

1.5 LDH 漏出率的检测

根据其试剂盒说明书进行操作。酶标仪检测(A450nm)待测组吸光度值。

1.6 SOD 的检测

根据其试剂盒说明书进行操作。酶标仪检测(A450nm)待测组吸光度值从而计算出SOD 含量。

1.7 Western blot 检测Srxn1 蛋白表达水平

提取细胞总蛋白，采用BCA 法测定蛋白浓度。根据所测蛋白浓度配平后进行上样、SDS 凝胶电泳、切胶、转膜、TBST 洗膜和封闭，加入稀释好的目的蛋白一抗4 ℃孵育过夜，复温20 min 后，TBST 洗膜，加入稀释好的目的蛋白的二抗，室温孵育1.5 h，TBST 洗膜，ECL 化学发光检测。运用Quantity One软件分析，检测目的蛋白条带吸光度值与内参β-actin 条带吸光度值。目的蛋白的相对表达量=目的蛋白条带吸光度值/内参β-actin 条带吸光度值。

1.8 Real-time QPCR 检测Srxn1 mRNA 表达水平

根据试剂盒说明书，提取细胞总RNA，反转录成cDNA 作为模板，进行QPCR 反应。引物序列:Srxn1 上游5'-CCCAAGGCGGTGACTACTAC-3'，下游5'-GGCAGGAATGGTCTCTCTCTGTG-3';β-actin 上游5'-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3'，下游5'-CCCAT ACCCACCATCACACC-3'。反应体系:2 μL cDNA 模板，各1 μL 10 mol/L 的上下游引物，12.5 μL 2 ×SYBR® Premix Ex Taq®，8.5 μL ddH2O2。反应条件:95 ℃10 s;95 ℃5 s，60 ℃15 s，72 ℃15 s，39个循环;72 ℃5 s，95 ℃持续。运用2ΔΔCt［10］方法Bio-Rad CFX Manager Software 软件进行分析。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠星形胶质细胞纯度鉴定及转染效率鉴定

传2 代星形胶质细胞胞体大，胞核大而圆常偏于胞体一侧。细胞突触分支多，且丰富，相互交织成网状。星形胶质细胞红色荧光阳性率达到90%以上(图1A，B)。同时观察到，细胞慢病毒载体的绿色荧光转染效率达到85%以上(图1C，D)。

2.2 Sh-RNA 干扰效率及干扰Srxn1 对氧化应激损伤的星形胶质细胞Srxn1 表达的影响

与对照组及阴性对照组相比，干扰Srxn1 后Srxn1 蛋白表达下调约59.2%(P＜0.01);H2O2处理后Srxn1 蛋白上调137.3% (P＜0.01)。与Sh-Srxn1组相比，Sh-Srxn1 + H2O2组的Srxn1 蛋白表达增高135.6%(P＜0.01)(图2)。与对照组相比较，干扰Srxn1 后Srxn1 基因水平降低至36.4%(P＜0.01)(图2)。

2.3 干扰Srxn1 对氧化应激损伤的星形胶质细胞损伤程度的影响

与对照组及阴性对照组相比，H2O2处理星形胶质细胞后，LDH 漏出率增加170.9%(P＜0.01)。当干扰Srxn1 后，细胞的损伤程度进一步增高98.2%(P＜0.01)(图3)。

2.4 干扰Srxn1 对氧化应激损伤的星形胶质细胞SOD 活性的影响

与对照组及阴性对照组相比，Sh-Srxn1 组SOD 活性降低32.8% (P＜0.01);H2O2组SOD 活性降低56.4%(P＜0.01);当给予H2O2处理后再干扰Srxn1，SOD 活性进一步降低76.9%(P＜0.05)(图4)。

图1 原代星形胶质细胞纯度及转染效率Fig 1 Identification of astrocytes purity and transfection efficiency(×200)

图2 Sh-RNA 干扰效率及干扰Srxn1 对氧化应激损伤的星形胶质细胞Srxn1 表达的影响Fig 2 The efficiency of Sh-RNA interference and the expression of Srxn1 in response to oxidative stress(n=3)

图3 干扰Srxn1 对氧化应激损伤的星形胶质细胞损伤程度的影响Fig 3 Sh-Srxn1 mediated Srxn1 increased cell damage(n=6)

2.5 干扰Srxn1 对氧化应激损伤的星形胶质细胞2-Cys Prdxs 和Prdx-SO2/3H 表达的影响

与对照组及阴性对照组相比，H2O2损伤后PrdxⅠ～Ⅳ和Prdx-SO2/3H 的蛋白水平上调(P＜0.01)。干扰Srxn1 则可抑制PrdxⅠ～Ⅳ蛋白水平的增高，提高Prdx-SO2/3H 蛋白水平的表达(图5)。

3 讨论

脑血管病是当今3 大致死疾病之一，是首位致残因素［4］。氧化应激很可能是造成缺血性脑血管病不可逆损伤的关键因素。前期研究表明Srxn1 可以保护PC12 细胞免H2O2诱导的氧化应激性损伤［5］。目前Srxn1 在星形胶质细胞中的抗氧化保护作用及可能机制尚不清楚。

图4 干扰Srxn1 对氧化应激损伤的星形胶质细胞SOD 活性的影响Fig 4 Effects of Srxn1 on superoxide dismutase(SOD)activity(n=6)

为了进一步探讨Srxn1 在脑血管疾病中的神经保护功能。本研究采用大鼠星形胶质细胞作为靶细胞，构建H2O2模型，应用慢病毒干扰技术，研究Srxn1 的神经保护。Srxn1 作为一个内源性的小分子抗氧化蛋白，在细胞受到外界损伤刺激会诱导其表达水平增高［6］。H2O2损伤后，Srxn1 蛋白水平升高。LDH 是衡量细胞损伤的重要指标，结果显示H2O2损伤后，细胞LDH 漏出率显著增加，且干扰Srxn1 后LDH 漏出率增加更显著。SOD 是反映氧化应激损伤的有效指标。H2O2损伤后，细胞内SOD活力明显下降，且干扰Srxn1 后使SOD 活力下降更为明显。这些结果表明干扰Srxn1 会加重细胞的氧化应激性损伤。

图5 干扰Srxn1 对氧化应激损伤的星形胶质细胞2-Cys Prdxs 和Prdx-SO2/3H 表达的影响Fig 5 Srxn1 depletion resulted in decreased expression of Prdxs and retarded the reduction of Prdx-SO2/3H(n=3)

Peroxiredoxins(Prdxs)属于新的不断扩展的抗氧化蛋白超家族，它包含PrdxⅠ～PrdxVI［3］。当脑缺血再灌注损伤发生时，Prdxs 过度氧化。在MCA供血区域，包在中枢神经系统中，Prdxs 作为自由基清除剂，对很多细胞起着重的保护作用，括皮质和纹状体［7］。在神经细胞体外缺血的研究中，2-Cys Prdxs 在高表达的模型和神经退行性病变组织中都起着重要的作用［8-10］。Srxn1 可以特异性地将过氧化的Prx-SO2/3H 还原为带有巯基的形式，恢复Prdxs 的抗氧化活性，可以进一步维持细胞内环境氧化/抗氧化平衡。在胶质细胞氧化应激损伤过程中是否存在着Srxn1 对其下游Prdxs 因子的调控作用未见有文献报道。结果显示，干扰Srxn1 后，2-Cys Prdxs 表达降低，而Prdx-SO2/3H 作为过氧化的标志物在星形胶质细胞中明显的增高。这些结果表明，在分子水平上Srxn1 可通过抑制Prdx-SO2/3H 的形成，增加2-Cys Prdxs 的活性而发挥抗氧化损伤的作用。

综上所述，Srxn1 作为一个重要的氧化应激诱导的基因，在干扰Srxn1 后导致星形胶质细胞对H2O2诱导的氧化应激性损伤的敏感性增加。Srxn1在星形胶质细胞氧化应激损伤中的确起着重要的保护作用。且Srxn1 可通过抑制Prdx-SO2/3H 的形成，提高抗氧化蛋白2-Cys Prdxs 的活性，从而发挥抗氧化应激损伤的作用。

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