苹果露中多酚物质的含量测定

李巍，辛立波，於洪建，赵余庆，*

（1.沈阳药科大学中药学院，辽宁沈阳110016；2.天津市尖峰天然产物研究开发有限公司，天津300457）

苹果露中多酚物质的含量测定

李巍1，辛立波1，於洪建2，赵余庆1，*

（1.沈阳药科大学中药学院，辽宁沈阳110016；2.天津市尖峰天然产物研究开发有限公司，天津300457）

利用HPLC法对苹果露中的生理活性成分进行含量测定。HPLC法采用Kromasil C18（4.6mm×150mm）色谱柱，流动相采用甲醇（A）-水（B）梯度洗脱，流速为1mL/min，柱温为25℃，检测波长为290 nm，测定苹果露中儿茶素和原花青素B2的含量，苹果多酚采用分光光度法测定；结果表明：苹果露中儿茶素和原花青素B2的平均含量分别为26.77mg/L和45.43mg/L，苹果多酚为2.92mg/mL；儿茶素、原花青素B2和苹果多酚在苹果露中均能检测到，且含量较高，为人们饮用苹果露对人体的保健作用提供了理论依据。

苹果露；儿茶素；原花青素B2；苹果多酚；HPLC

苹果中含有丰富的营养成分被列为我国四大水果之首[1]。近年来，苹果种植面积和产量大幅度增加，全国苹果总产量已超过2 000万t/a，居世界首位，全国近10个省区都把苹果产业作为当地的支柱产业来发展[2]。随着果品产量的迅速增加，人们对苹果的综合开发、利用的研究也日趋关注，苹果多酚的开发与利用成为近年来人们关注的对象之一。苹果多酚是苹果中天然存在的一类重要生物活性物质，苹果多酚具有多种保健功能，如预防龋齿、预防高血压、预防过敏反应、抗肿瘤；抗突变、阻碍紫外线吸收等生理功能，另外还对化学性及药物性肝损伤具有良好的保护作用，因此可用于保健食品及化妆品的制造[3-6]。苹果多酚包括多种酚类物质，可分为酚酸及其羟基酸酯类、糖类衍生物和黄酮类化合物，如儿茶素、表儿茶素、原花青素、二羟基查耳酮、黄酮醇配糖体等[7-8]。儿茶素是茶多酚的主要成分，现代药理研究表明，儿茶素具有抗氧化、防辐射、护肤美容、减缓香烟毒害等多种功效[9]。原花青素B2属于低聚花青素，它可以清除体内的自由基和活性氧，能预防因人体血液中低密度脂蛋白氧化而引起的动脉硬化等[10-12]，另外在制备防治糖尿病及血管并发症药物的应用方面国内已经申请专利[13]。苹果露是以天然优质浓缩苹果汁为原料，经过提纯，制剂与食品工艺相结合制成的苹果味营养露。本品富含丰富的苹果多酚、原花青素等对人体健康有益的功效成分。本研究运用HPLC法及分光光度法对苹果露中儿茶素、原花青素B2和苹果多酚的含量进行了测定，以期为科学地评价苹果露的品质和为人们饮用苹果露对人体的保健作用提供理论依据。

1 仪器与试剂

高效液相色谱仪：knauer德国；UV-2800AH紫外可见分光光度计：上海尤尼可；Sartorius电子天平：北京赛多利斯。

原花青素B2、苹果多酚标准品：天津市尖峰天然产物研究开发有限公司，≥98%；儿茶素：中国药品生物制品检定所，批号：878-200102；苹果露：天津市壹杯红生物技术有限公司；甲醇（色谱纯）；双重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 儿茶素和原花青素B2的测定

2.1.1 色谱条件

Kromasil C18色谱柱（150mm，4.6mm）；流动相采用甲醇（A）：水（B）梯度洗脱，0～20min，22%A；24min，25%A；32min，30%A；39min，40%A；44min，50%A；55min，60%A；60min，80%A；65min～70min，100% A；流速为1mL/min；柱温25℃；检测波长为290 nm；每次进样10μL，进样前使用0.22μm滤膜过滤。

2.1.2 标准曲线的制备

准确称取儿茶素对照品2mg和原花青素B2对照品2mg置于10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。精密吸取适量混合对照品溶液，进样测定峰面积值。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。儿茶素：y=175 155x-905.47，r= 0.999 7表明儿茶素在0.2μg～1.2μg范围内与峰面积线性关系良好。原花青素B2：y=268 391x+27 862，r= 0.999 8表明原花青素B2在0.2μg～1.2μg范围内与峰面积线性关系良好。

2.1.3 精密度试验

精密吸取第二批苹果露样品10μL连续进样5次，测定色谱峰面积。结果显示儿茶素和原花青素B2峰面积的RSD%分别为0.7%和0.9%。

2.1.4 重现性试验

精密吸取第二批苹果露样品10μL共5份，进样，测定色谱峰面积。结果显示儿茶素和原花青素B2峰面积的RSD%分别为0.8%和1.1%，表明本试验测定方法的重复性良好。

2.1.5 稳定性试验

分别在0、4、8、12、24 h精密吸取第二批苹果露样品10μL进样，测定色谱峰面积。结果显示儿茶素和原花青素B2峰面积的RSD%分别为1.2%和1.3%，表明在此时间内供试品溶液性质稳定。

2.1.6 加样回收率试验

精取吸取第二批苹果露样品，共5份，分别加一定量的儿茶素和原花青素B2对照品，分别精密吸取10μL进样，测定，平均回收率分别为98.2%和101.5%， RSD%分别为1.3%和1.6%。

2.1.7 样品的测定

吸取苹果露样品经0.22μm滤膜超滤备用。取对照品和供试品溶液进样测定，色谱图见图1。

图1 标准品和苹果露样品的HPLC图谱Fig.1 Chromatograms of reference substances（A）and Apple-dew（B）

定量方法采用外标法，结果见表1。

表1 苹果露中儿茶素、原花青素B2和苹果多酚测定结果Table1 Determination of catechin，Proanthocyanidin B2and apple-polyphenol

由表1中数据可知，三批苹果露样品中儿茶素和原花青素B2的平均含量分别为26.77mg/L和45.43mg/L。

2.2 苹果多酚的测定

2.2.1 标准曲线的绘制

准确称取标样苹果多酚，加95%乙醇配制成0.05、0.15、0.25、0.45、0.65mg/mL溶液，取3mL置于25mL具塞试管中，分别加入0.2mL 2%的NH4Fe（SO4）2[2mg NH4Fe（SO4）2用1mol/L的盐酸定容到100mL]与6mL盐酸正丁醇溶液（95mL正丁醇加5mL浓盐酸），摇匀，置95℃水浴反应40min，取出，立即冷却，待用。检测波长：546 nm。以吸光度对质量浓度进行回归，得原花青素标准曲线方程y=3.701 7x+0.186 5，r=0.999 7，结果表明原花青素在0.05mg/mL～0.65mg/mL范围内与吸光度的线性关系良好。

2.2.2 样品溶液配制

精取苹果露5mL，置于25mL量瓶中，用95%乙醇稀释至刻度。取3mL稀释的苹果露样品于25mL具塞试管中，按照标准品制备的方法配制。

2.2.3 精密度试验

精密称取样品溶液3mL，连续测定5次吸光度值。结果显示苹果多酚吸光度值的RSD为0.1%。

2.2.4 重现性试验

精密取样品溶液共5份，制备供试品溶液，测定吸光度。结果苹果多酚吸光度的RSD为0.2%。

2.2.5 稳定性试验

分别在0、4、8、12、24 h精密吸取样品溶液，测定吸光度。结果苹果多酚吸光度的RSD为0.5%，表明在24 h内供试品溶液稳定。

2.2.6 加样回收率试验

取苹果露样品5份，分别加1mg苹果多酚对照品，制备供试品溶液，测定，结果平均回收率为99.37%，RSD为2.7%。

2.2.7 样品测定

取各批苹果露样品，制备供试品溶液，进行测定，将结果代入苹果多酚标准曲线方程，计算，结果见表1。由测定结果可以得到，三批苹果露样品中苹果多酚含量分别为3.05、2.74、2.96mg/mL，苹果露样品中苹果多酚平均含量为2.92mg/mL。

3 讨论

通过对苹果露进行HPLC分析发现苹果露中成分较为复杂，在保留时间在46.1min和47.8min有两个紫外检测器下显示含量较高的成分，但未能对其进行定性，我们将通过的接续的研究，运用现代分析技术方法对其进行定性和定量，以期为苹果露的质量控制及营养保健作用提供进一步的理论基础。

苹果多酚经多年的研究、实验及开发应用，以其优越的性能为人们所青睐。苹果多酚制品由于在水中或醇中具有良好的溶解性，被广泛应用到功能性食品和化妆品等领域。同时既可作为食品添加剂，又可作为防腐剂替代合成防腐剂，提高了其应用的安全性。我国苹果资源十分丰富，但苹果加工的产品品种单一，果皮、果渣中的多酚物质被废弃，资源综合利用和深加工程度低，因此，探讨新的作用机理及研究新的方法，对开发苹果多酚类产品将具有深远意义。

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Determination of Polyphenolic Compounds in Apple-dew

LI Wei1，XIN Li-bo1，YU Hong-jian2，ZHAO Yu-qing1，*
（1.School of Tradition Chinese Materia Medica，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang110016，Liaoning，China；2.Tianjin Jianfeng Natural Product Co.，Ltd，Tianjin，300457，China）

Phenolic compounds，i.e.，catechin，proanthocyanidin B2and appjfnol in Apple-dew were analyzed. Proanthocyanidin B2and catechin were determined by HPLC.Appjfnol was determined by spectrophotometric method.The average content of proanthocyanidin B2，catechin and appjfnol in Apple-dew was 45.43 mg/L，26.77mg/Land 2.92mg/mL，respectively.

Apple-dew；catechin；proanthocyanidin B2；appjfnol；HPLC

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.010.019

2013-05-13

国家农业科技成果转化资金（2007GB2A100022）；辽宁省博士启动资金（20111135）

李巍（1981—），女（汉），讲师，博士，研究方向：食品药学。

*通信作者：赵余庆（1957—），男，教授，研究方向：食品药学。