葡萄籽提取物原花青素对肉兔抗氧化功能、脂质含量及血清代谢产物浓度的影响

汪水平 杨大盛 李艳莎 姜仁辉 程春霞 莫念等 邱 浩

（西南大学荣昌校区，重庆 402460）

近年来，植物及其提取物因其低毒副作用及所具有的天然性、多功能性和环保性，在动物生产中广泛应用，以期替代抗生素。原花青素是植物中广泛存在的一大类多酚化合物的总称，属于生物类黄酮大家族中的一员，由不同数量的儿茶素、表儿茶素或没食子酸经C4～C6或C4～C8键缩合而成［1］。它广泛分布于植物界，在许多植物的根、茎、叶、花及果实中均含量丰富，其中以葡萄籽含量最高［2］。原花青素潜在抗氧化能力分别是维生素E和维生素C的20倍和50倍，具有非常强大的抗氧化和清除自由基的活性［3］。同时，原花青素在保护心脑血管系统、预防与治疗糖尿病、防癌抗癌、抗炎症、防治胃肠道溃疡、抑制病原微生物、改善免疫抑制、改善微循环及保护皮肤等方面均具有一定药理作用，是发达国家最受欢迎的植物药之一［4］。可见，原花青素药理学特性独特，资源丰富，具有开发成抗生素替代品的潜力。目前，原花青素已被广泛应用于食品、保健品、药品及化妆品等领域。在美国，原花青素列入了食品添加剂目录，并经美国食品与药品管理局认定为“Generally Recognized as Safe”［5］。不过，将原花青素作为饲料添加剂在动物生产中使用的研究报道很少。基于此，本试验以葡萄籽提取物原花青素（grape seed proanthocyanidin extracts，GSPE）为试验材料，通过给生长期新西兰兔饲喂GSPE添加量不同的饲粮，借助对抗氧化功能、脂质含量及血清代谢产物浓度的考察，评估GSPE的应用效果，试图阐明其作用机理，为其在生产实践中应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

GSPE：天津市尖峰天然产物研究开发有限公司，提取自葡萄（Vitis vinifera L.）籽，为红棕色粉末，气微、味涩，纯度不少于95%。

1.2 试验设计

选用128只60日龄、体重相近的建康新西兰兔作为试验动物，公母各50%。采用单因子随机区组试验设计，将128只新西兰兔随机分为4组（1个对照组和3个试验组），每组32个重复，每个重复1只。对照组饲喂基础饲粮，3个试验组分别饲喂在基础饲粮中添加100、200及400 mg／kg GSPE的试验饲粮。试验期为39 d，其中预试期为6 d，正试期为33 d。试验组肉兔在预试期内由基础饲粮逐渐过渡到试验饲粮。

1.3 基础饲粮

基础饲粮参考 NRC［6］和 de Blas［7］推荐的生长兔饲养标准配制，其组成及营养水平见表1。所有饲料原料过1.5 mm筛粉碎，按不同组别分别混匀，再采用冷制粒工艺制成直径为4 mm的颗粒料，65℃烘干，用塑料袋密封，常温保存待用。

表1 基础饲粮的组成及营养水平（干物质基础，%）

1.4 饲养管理

试验于2012年3月13日到2012年4月20日在重庆市荣昌县西南大学荣昌校区“7+5”肉兔养殖创业组进行。兔舍为2层双列式，每笼饲养1只。采用颗粒料饲喂，自由采食与饮水，日喂2次（07：00和18：00），每次投料少量多添，每次投料时间不得少于2 h。兔舍自然采光，自然通风，日打扫卫生1次，保持兔舍清洁卫生。经测定，试验期兔舍内温度平均为18.30℃，相对湿度平均为75.17%，温湿指数平均为63.66。试验期间，按兔场规定进行防疫、驱虫和消毒，并密切观察试验兔行为，发现异常立即处理。

1.5 样品采集及预处理

1.5.1 血液样品采集及预处理

在正式期结束的第2天，从每组中挑选16只接近各组平均体重的试验兔，晨饲前心脏采血16 mL，室温斜置静放1～2 h，3 000 r／min低温离心15 min，得血清-80℃下保存待测。使用贝克曼库尔特SYNCHRON CX5 PRO全自动生化仪测定血清代谢产物浓度。其中，葡萄糖（glucose，Glu）采用己糖激酶终点法，尿素氮（urea nitrogen，UN）采用脲酶 UV法，尿酸（uric acid，UA）采用重组尿酸氧化酶法，三酰甘油（triglyceride，TG）和总胆固醇（total cholesterol，TCHO）采用GPO-PAP法。总抗氧化能力（total antioxidative capacity，T-AOC）、总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）与谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性及丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）浓度等血清抗氧化功能参数均按购自南京建成生物工程研究所的试剂盒上提供的方法进行测定。

1.5.2 背最长肌样品采集及预处理

采血后的试验兔采用耳缘静脉注射空气法致死，尽可能取同侧背最长肌的同一部位，立即按照GB／T 6433—2006直接测定粗脂肪（ether extract，EE）含量，并按试剂盒上提供的方法，制备10%匀浆，再测定 T-AOC、T-SOD与 GSH-Px活性及MDA浓度等抗氧化功能参数。

1.5.3 肝脏样品采集及预处理

尽可能取肝脏的同一部位，立即按照 GB／T 6433—2006直接测定EE含量，并按试剂盒上提供的方法，制备10%匀浆，再测定 T-AOC、T-SOD与GSH-Px活性及MDA浓度等抗氧化功能参数。

1.6 统计分析

数据基本处理用Excel2003软件进行，结果采用SPSS 11.5软件中的GLM模块进行方差分析和显著性检验，多重比较用Duncan法，结果用平均数±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 试验兔背最长肌、肝脏及血清抗氧化功能参数

由表2可知，随饲粮中GSPE添加量升高，试验兔背最长肌、肝脏及血清T-AOC、T-SOD与GSHPx活性均显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）升高，而MDA浓度极显著（P＜0.01）降低。

表2 试验兔背最长肌、肝脏及血清抗氧化功能参数

表2 （续）

2.2 试验兔背最长肌、肝脏及血清脂质含量

由表3可知，对照组试验兔背最长肌EE含量极显著（P＜0.01）高于 200 mg／kg组和400 mg／kg组，而肝脏EE含量、血清TG与TCHO浓度均显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）高于其余3组。

表3 试验兔背最长肌、肝脏及血清脂质含量

2.3 试验兔血液指标

由表4可知，对照组试验兔血清GLU与UN浓度均显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）高于其余3组，而UA浓度显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）低于200 mg／kg组和400 mg／kg组。

表4 试验兔代谢产物浓度

3 讨论

3.1 GSPE对肉兔抗氧化功能的影响

自由基具有强大的氧化能力。机体内自由基防御系统极为复杂，包括酶系统和非酶系统，其中以酶系统为主。酶系统主要包括超氧化物歧化酶、GSHPx、过氧化氢酶及过氧化物酶等，非酶系统主要包括维生素类抗氧化剂、微量元素及谷胱甘肽等，两者一起协同防止自由基的蓄积。由于苯酚羟基基团的存在，可为脂肪氧化第一步产生的过氧化物基团提供氢，故GSPE具有极强的抗氧化活性，能有效清除细胞内的活性氧，从而缓解氧自由基的毒害，是一种高效的自由基清除剂和脂质过氧化抑制剂［8］。并且，GSPE的其他生理功能，主要基于其抗氧化活性［9］。GSPE可通过直接猝灭自由基、改善机体抗氧化酶的活性及螯合金属离子以形成惰性化合物而发挥其抗氧化的生理功能，还可再生维生素C、维生素E等抗氧化剂［10］。本试验中，饲粮添加GSPE，试验兔背最长肌、肝脏及血清的T-SOD与GSH-Px活性得到提高，T-AOC得到改善，而 MDA得到降低，表明GSPE对肉兔具有抗氧化作用，且效果随添加量升高而提高。

3.2 GSPE对肉兔脂质代谢的影响

GSPE对机体脂质代谢的调节作用已被证实。GSPE可降低血清和肝脏中总胆固醇、三酰甘油及低密度脂蛋白胆固醇含量，提高血清卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶活性，加速胆固醇逆向转运，促进胆固醇的肝脏代谢，增加粪胆汁酸的排泄，从而间接增加胆固醇的体外排出。Pajuelo等［11］报道，给进食高胆固醇饲料的大鼠饲喂GSPE，能阻止血清低密度脂蛋白胆固醇的升高和高密度脂蛋白胆固醇的降低，也能抑制肝脏EE与TCHO含量的增加，还能促进类脂和胆固醇经粪便的排泻，提示GSPE具有降低体内胆固醇的潜力。王淑娥等［12］将40只小鼠随机分为正常对照组（饲喂普通饲料）、高脂模型组（饲喂高脂饲料）及GSPE组（饲喂高脂饲料的同时，按每g体重0.2和0.6 mg的标准添加GSPE），饲喂20周，结果发现，GSPE组小鼠眼球血清TCHO和TG浓度升高的幅度较高脂模型组明显减少，提示GSPE对高脂膳食致小鼠血脂升高有一定的阻抑作用。凌智群等［13］发现，在高脂饲料中添加100和400 mg／kg莲房提取物原花青素，均可有效降低肝脏和血清中TCHO和TG含量，明显升高血清高密度脂蛋白胆固醇浓度，降低血清低密度脂蛋白胆固醇浓度。本试验中，饲料添加 GSPE，可显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）降低试验兔背最长肌和肝脏EE含量及血清TG和TCHO浓度，表明GSPE可降低肉兔组织和血液的脂质含量，调节机体脂质代谢，这与上述研究结果一致。

3.3 GSPE对肉兔血清代谢产物浓度的影响

血液是机体运输营养物质和代谢产物的载体，也是实现体液调节的途径。因此，血清代谢产物是反映机体全身或局部代谢变化和组织生理功能的较为敏感的指标。GLU作为重要的营养性单糖，是机体代谢活动快速应变需能的最有效营养素，是大脑神经系统、肌肉、脂肪组织、胎儿生长发育及乳腺等代谢的唯一能源［14］。血液GLU浓度的相对恒定对维持机体正常的生理功能具有十分重要的作用，机体的某些病理状态能引起糖代谢障碍，使GLU浓度过高或过低，进而引起各种疾病，甚至危及生命。基于对胰岛素敏感细胞系的胰岛素样作用与抗氧化活性，GSPE能改善糖尿病状态的氧化形式，可用于预防和治疗糖尿病［15］。Bao-ing Li等［16］报道，给链脲霉素诱导的糖尿病大鼠口服 GSPE，可降低血液GLU、糖基化血红蛋白及糖基化终产物的浓度，若同时注射低剂量胰岛素，作用效果会明显增强。谢文利等［17］发现，原花青素可明显降低糖尿病大鼠血清GLU浓度，提高正常大鼠糖耐量。Schafer等［18］认为，临床中观察到的口服松树皮提取物原花青素后对糖尿病患者的血液GLU降低作用与原花青素抑制α-糖苷酶有关。本试验结果表明，GSPE可降低肉兔血清GLU浓度，这与上述研究结果一致。不过，饲粮中GSPE的添加量与试验兔血清GLU浓度降低的程度关系不大，说明GSPE的安全性非常高，不会影响机体维持正常生理功能所需的GLU浓度。血液中非蛋白氮主要是蛋白质代谢的中间或终末产物，包括UN、UA、肌酸、肌酐、胆红素和氨等。汪水平等［19］认为，血清UN浓度直接反映了动物机体蛋白质的代谢状况，蛋白质代谢良好时，UN浓度会降低。王文娟等［20］指出，血清UN浓度可较准确地反映动物体内蛋白质代谢和氨基酸之间的平衡状况，氨基酸平衡良好时血清UN浓度会降低。本试验中，试验兔血清UN浓度随饲粮中GSPE添加量的升高而降低，表明GSPE能在一定程度上改善肉兔对含氮物质的利用效率。林荣海等［21］和陈佳铭等［22］发现，原花青素可促进血红蛋白与血清蛋白的合成，具有抗贫血和改善蛋白质代谢的作用，从而提高营养物质利用效率，这与本试验结果相近。UA是蛋白质和核酸的一种代谢产物，高浓度的UA会沉积在动物的关节处，引起痛风，也会引起高血压等相关疾病，但是UA也是一种极强的抗氧化剂，能减轻自由基对蛋白质、DNA及膜脂质的损害，从而达到抗衰老、抗癌等作用［23］。本试验中，试验兔血清 UA浓度随饲粮中GSPE添加量的升高而升高，这可能是在GSPE影响下机体抗氧化能力提高的一种表现。

4 结论

饲粮中添加200与400 mg／kg GSPE，肉兔背最长肌EE含量极显著（P＜0.01）降低，而血清UA浓度显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）升高。饲粮中添加100、200及400 mg／kg GSPE，肉兔背最长肌、肝脏及血清 MDA浓度、肝脏 EE含量、血清 TG、TCHO、GLU及 UN浓度显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）降低，而背最长肌、肝脏及血清T-AOC、T-SOD与GSH-Px活性显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）升高。

［1］Bagchi D，BachiM，Stohs SJ，etal.Free radical and grape seed proanthocyanidin extract：importance in human health and disease prevention［J］.Toxicology，2000，148：187-197

［2］Perumalla A V S，Hettiarachchy N S.Green tea and grape seed extracts-potential applications in food safety and quality［J］.Food Research International，2011，44：827-839

［3］Shi J，Yu J，Pohorly JE，etal.Polyphenolics in grape seeds-biochemistry and functionality［J］.Journal of Medicinal Food，2003，6：291-299

［4］Cos P，de Bruyne T，Hermans N，et al.Proanthocyanidins in health care：current and new trends［J］.Current Medicinal Chemistry，2004，11：1345-1359

［5］Clouatre D L，Kandaswami C.Grape seed extract［A］.In：Coates P，Blackman M，Cragg G（Eds.）.Encyclopedia of dietary supplements［M］.New York，NY：Marcel Dekker，2005：309-325

［6］NRC.Nutrient requirements of rabbits（2thed）［M］.Washington，D C：National Academy Press，1977：45-55

［7］de Blas C，Mateos G G.Feed formulation［M］.de Blas C，Wiseman J.The nutrition of the rabbit.New York：CABI Publishing，1998：241-253

［8］Yilmaz Y，Toledo R T.Major flavonoids in grape seeds and skins：Antioxidant capacity of catechin，epicatechin，and gallic acid［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52：255-260

［9］Victor P，Lidia C，Anna C A，et al.Effects of grape seed procyanidin extract over low-grade chronic inflammation of obese Zucker fa／fa rats［J］.Food Research International，2013，53：319-324

［10］Morin B，Narbonne JF，Ribera D，et al.Effect of dietary fat-soluble vitamins A and E and proanthocyanidin-rich extract from grape seeds on oxidative DNA damage in rats［J］.Food and Chemical Toxicology，2008，46：787-796

［11］Pajuelo D，Quesada H，Diaz S，et al.Chronic dietary supplementation of proanthocyanidins corrects themitochondrial dysfunction of brown adipose tissue caused by diet-induced obesity in Wistar rats［J］.British Journal of Nutrition，2012，107：170-178

［12］王淑娥，于红霞，赵秀兰，等.葡萄籽提取物对小鼠血脂水平的影响［J］.实用预防医学，2002，9（5）：445-446

［13］凌智群，谢笔钧，周顺长，等.莲房原花青素对家兔血脂及肝组织形态的影响［J］.天然产物研究与开发，2002，13（4）：62-64

［14］王文娟，汪水平，左福元.反刍动物淀粉消化与葡萄糖吸收研究进展［J］.西北农林科技大学学报（自然科学版），2008，36（5）：27-34

［15］高羽，董志.原花青素的药理学研究现状［J］.中国中药杂志，2009，34（6）：651-655

［16］Bao-ing Li，Mei Cheng，Hai-Qing Gao，et al.Backregulation of six oxidative stress proteins with grape seed proanthocyanidin extracts in rat diabetic nephropathy［J］.Journal of Cellular Biochem istry，2008，104：668-679

［17］谢文利，孙静，赵艳威，等.原花青素的降血糖作用及急性毒性研究［J］.中草药，2009，40（10）：1615-1616

［18］Schafer A，Hogger P.Oligomeric procyanidins of French maritime pine bark extract（Pycnogenol）effectively inhibit alpha-glucosidase［J］.Diabetes Research and Clinical Practice，2007，77：41-46

［19］汪水平，王文娟，谭支良.反刍动物体内氨与尿素代谢研究进展［J］.西北农林科技大学学报（自然科学版），2009，37（2）：62-72

［20］王文娟，汪水平，谭支良.反刍动物瘤胃氮代谢研究进展［J］.华中农业大学学报，2007，26（5）：747-754

［21］林荣海，陈佳铭，黄顺捷，等.前花青素饲料添加剂促进断奶仔猪生长增重的试验研究［A］.福建省农业工程学会2009年学术年会论文集［C］.福州：福建省农业工程学会，2009：48-51

［22］陈佳铭，林荣海，黄顺捷，等.前花青素饲料添加剂增强断奶仔猪免疫力的试验研究［J］.中兽医学杂志，2009，（增刊）：58-62

［23］SuwannaphetW，Meeprom A，Yibchok-Anun S，et al.Preventive effectof grape seed extractagainsthigh-fructose diet-induced insulin resistance and oxidative stress in rats［J］.Food and Chemical Toxicology，2010，48：1853-1857.