连钱草总黄酮提取工艺优化

1.湖北民族学院生科院，湖北 恩施 445000；2.南京同仁堂洪泽中药材科技有限公司，江苏 洪泽 223200；3.南京医药股份有限公司博士后工作站，江苏 南京 210012

连钱草为唇形科活血丹属植物活血丹[Glechomalongituba(Nakai) Kupr.]干燥地上部分。连钱草性味凉辛，微苦，微寒。归肝、肾、膀胱经[1]，具有利胆、利尿、抗菌、抗炎、降血糖、抗肿瘤以及抗腹泻等药理作用，主治黄疸型肝炎、胆囊炎、胆石症、疳积、肾结石、膀胱结石、多发性脓疡、疮痈肿痛、婴儿湿疹、跌打损伤、腮腺炎、牙痛等症[2]。

连钱草的主要化学成分有萜类[3]、黄酮[4,5]、挥发油[6]、有机酸[7,8]以及多糖等。其中，萜类化合物主要包括熊果酸、齐墩果酸、乌苏酸、2-羟基乌苏酸等；黄酮和黄酮苷类化合物包括木犀草素、芦丁、芹菜素、刺槐素、海常素、胡萝卜苷、槲皮素、连钱草酮等；挥发油类化合物包括左旋薄荷酮、胡薄荷酮、旅烯、柠檬烯、1,8-桉叶素、异薄荷酮、异松樟酮、α-松油醇等，具有特殊的清香味；有机酸类化合物包括阿魏酸、咖啡酸、介子酸、月桂酸、迷迭香酸、原儿茶醛、迷迭香酸甲酯、三十烷酸、肉豆蔻酸等有机酸。

目前针对连钱草总黄酮提取工艺的研究尚不多见。本研究通过考察提取时间、提取温度、液固比和乙醇等因素，采用单因素试验和Box-Behnken试验优化了连钱草总黄酮的提取工艺，结果理想，报告如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器 TU-1810型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)、RT-02A型多功能粉碎机(弘荃机械企业有限公司)、BECKMAN COUCTER型离心机(美国BECKMAN公司)、HHS型恒温水浴锅等仪器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)。

1.2 试药 连钱草由南京同仁堂洪泽中药材科技有限公司提供(经姜宁副教授鉴定为唇形科活血丹属植物活血丹[Glechomalongituba(Nakai) Kupr.])，烘干，粉碎，过60目筛；无水乙醇、芦丁、亚硝酸钠、硝酸铝等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

2 方法与结果

2.1 黄酮含量的测定 以芦丁为标准品，参照文献[9]进行。

2.2 Box-Behnken试验

2.2.1 Box-Behnken试验设计 在预试验基础上，采用 Design-Expert 8.0的Box-Behnken 设计，以提取时间、温度、液固比、乙醇浓度为自变量，黄酮提取率为响应值。试验因素水平设计和结果分别见表1、表2。

表1 因素水平编码

表2 Box-Behnken试验结果

根据试验结果，建立了如下回归模型：R=6.38-0.16A+0.057B+0.44C+0.11D+0.15AB+0.11AC+0.62AD+0.36BC+0.030BD+0.013CD-0.63A2-0.61B2-0.85C2-0.54D2。该回归模型的决定系数R2为0.9746，校正后的决定系数(adj-R2)为0.9493，说明该模型拟合性较好。对回归模型和各因子进行方差分析，结果见表3。从表3可知：该模型F值为38.41，P值<0.0001，而失拟性试验F值为2.19，不显著，说明此模型与实际情况拟合得较好。根据F值和P值，可以得出各因素对响应值的作用由大到小为：C2>A2>B2>C>D2>AD>BC>A>D>AB>AC>B>BD>CD。其中：B、AB、AC、BD、CD对响应值的作用不显著，所以上述回归方程中以上几项可以忽略，所得回归方程如下：R=6.38-0.16A+0.44C+0.11D+0.62AD+0.36BC-0.63A2-0.61B2-0.85C2-0.54D2。

表3 Box-Behnken试验结果方差分析表

2.2.2 优化工艺的确定 由Box-Behnken试验结果所得的回归方程，可以计算出当A=-0.05，B=0.13，C=0.28，D=0.08时，R有极大值6.45%。将各因素的水平回代，可以得到最优工艺是提取时间1.4975h，41.3℃，液固比22.8∶1，乙醇浓度90.4%时，黄酮提取率最高。为了操作方便，将优化的工艺确定为提取时间1.5h，提取温度41℃，液固比23∶1，乙醇浓度90%，并对该工艺进行了验证，连钱草黄酮提取率在6.32%～6.47%之间。说明经过响应面法优化的工艺具有很强的实践指导作用。

2.2.3 响应面分析 图1为响应面分析。从中可以看出：当C=0.28，D=0.08时，黄酮的提取率随着A和B的增加而上升，当达到最大值后，A和B的上升反而会使提取率下降(图1A)；B和D分别为0.13、0.08时，A和C处于低水平时，响应值较低，随着A和C的升高，响应值也随之升高，当到一定程度后，响应值不再随A和C的上升而上升，而是下降(图1B)；如B=0.13、C=0.28，A和D的变化会显著影响黄酮的提取率，当A和D较小时，黄酮提取率也较低，当A和D增大后，提取率也增高，当提取率达到极大值后，其会随着A和D的上升而下降(图1C)；图1D显示了B和C对响应值的影响，响应值开始随着B和C的上升而上升，当达到一定值后，反而会随着B和C的上升而下降； 随着B和D的变化，响应值的变化则较平缓(图1E)；A=-0.05、B=0.13时，当C和D较小时，提取率也较低，C和D上升后，提取率也增加，当提取率达到最大值后，C和D的增加反而会使提取率下降，不过下降的幅度较上升的幅度平缓(图1F)。

3 讨论

提取时间、提取温度、液固比和乙醇浓度是影响黄酮提取率的四个主要因素。提取时间的延长会增加植物体内的黄酮溶出，当提取达到一定时间后，连钱草黄酮的提取率不再显著增加，这是因为浸出液中黄酮与植物内的黄酮浓度差缩小，黄酮溶出速度下降。提取温度41℃时连钱草黄酮的提取率最高，随后温度的提高反而会使提取率下降，说明高温可能会破坏连钱草黄酮的结构。液固比的增加会提高植物内黄酮与浸出液中黄酮的浓度差，从而加快黄酮的溶出，但当液固比过大时，会使后续处理繁琐，加大处理过程中的损耗从而使提取率下降。本研究中乙醇浓度较高时，连钱草黄酮的提取率较大，说是连钱草黄酮在高浓度的乙醇溶液中溶解性较好。响应面法是优化黄酮提取工艺常用的方法之一，本研究通过响应面法优化的连钱草黄酮提取工艺得到验证，有很好的实用性。

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[2]宋锐，张云，丛晓东，等．连钱草的化学成分及生物活性研究进展[J]．中华中医药学刊，2010，28(12)：2511-2514．

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[4]杨念云，段金廒，李萍，等．连钱草中的黄酮类化学成分[J]．中国药科大学学报，2005，36(3)：210-212．

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[6]吴丽群，江芳．连钱草挥发油化学成分的研究[J]．中国医药科学，2012，2(23)：101-102．

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