成年 Beagle犬展神经损伤后神经核内神经再生的研究△

张毅 陈霞 周凌云 虞昊 杨洪滨

展神经是眼运动神经之一，起自脑桥下部的展神经核，具有支配眼球眼外肌运动的功能。由于展神经全程走行复杂，经过Dorello管、海绵窦、眶上裂等许多重要的结构，并与颈内动脉、交感神经、Gruber韧带等结构毗邻，因此颅内炎症、肿瘤、外伤、颅内高压、眼部病变等常导致展神经损伤，严重影响患者的生活质量［1］。以往的观念认为脑神经损伤后不能再生［2］，但近年来众多学者研究发现一些脑神经损伤后也有再生现象［3-6］。本次我们对展神经损伤后展神经核内是否有神经再生现象进行了深入的研究，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年Beagle犬22只(南通大学动物实验场提供)，年龄1～2岁，体质量10～20 kg，体长70～100 cm。对照组(2只)和实验组分为损伤后1 d、3 d、7 d、14 d、28 d五组(各4只)，实验许可证号:SCXK(苏):2008-0010。每只笼内最多饲养1只，实验前、后在标准实验条件下饲养。

1.2 展神经损伤模型制备 实验组Beagle犬术前12 h禁食，4 h禁水，腹腔内注射30 g·L－1戊巴比妥钠(1 mL·kg－1)麻醉。将Beagle犬置于侧卧位，头向对侧旋转，头部置于头圈上，耳缘牵向中线和尾侧。常规消毒、铺巾，开颅皮瓣翻向外侧并缝线固定。于颞肌附着处切开颞肌，在颞骨上保留一小片颞肌附着缘，以便关颅时缝合。经颞底入路开颅，骨窗要尽量靠近颅底，用高速梅花钻和显微咬骨钳形成从眶后到颧弓前足够大骨窗，扩大约3.0 cm×3.0 cm，即可沿骨窗下缘切开硬膜并呈放射状剪开。通过向内、上方牵拉颞叶牵开脑组织，磨除岩骨前部，可见深部的展神经(图1)，穿过脑桥前池，在神经切断后应用双极电凝处理神经断端，并将近侧端翻向脑干方，术中给予生理盐水500 mL+庆大霉素16万U静脉滴注，术后当天开始连续3 d肌肉注射青霉素160万U。保证实验室温度在25℃左右，术中注意动物保暖。对照组Beagle犬同实验组的手术入路暴露展神经，但不损伤神经。

1.3 BrdU静脉注射 对照组和实验组术后每只犬静脉注射BrdU 50 mg·kg－1，每天2次(早7∶00和晚7∶00)，连续7 d。1 d组术后1 d注射BrdU、3 d组术后连续3 d注射BrdU，以此类推。

1.4 组织固定及切片 BrdU末次注射后2 h灌注取材。犬麻醉后，开胸经心灌注生理盐水及含有40 g·L－1多聚甲醛的0.1 mol·L－1PBS(pH 7.2)，取脑后固定6 h，再分别经200 g·L－1、300 g·L－1蔗糖平衡，行冠状位冰冻连续切片，片厚20 μm。共收集各犬展神经核部位前、中、后3套切片，均贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片上待染色。

1.5 免疫荧光染色 取上述切片，用0.01 mol· L－1PBS(pH 7.2)漂洗后，每张切片滴加体积分数10%山羊血清50 μL封闭过夜，然后用一抗孵育:兔抗-BrdU(1∶100，Abcam)、鼠抗-nestin(1∶2000，Millipore)、豚鼠抗 DCX(1∶1000，Millipore)、鼠抗-GFAP(1∶500，Millipore)，4℃湿盒孵育24 h，用0.01 mol·L－1PBS(pH 7.2)漂洗3遍，在避光条件下，用二抗孵育:结合有Alexa Fluor 594的羊抗兔二抗(1∶1000，Molecular Probes)、结合有Alexa Fluor 488的羊抗鼠或豚鼠的二抗(1∶200，invitrogen)4℃湿盒孵育24 h，在避光条件下，PBS洗片3遍后，中性甘油封片。荧光显微镜下观察免疫荧光阳性的细胞数并摄片。

Figure 1 Abducens nerve(arrow) 展神经(箭头示)

2 结果

2.1 展神经损伤后功能测定 所有存活Beagle犬术后均生存良好，无感染、角膜溃疡等并发症，展神经切断后，犬眼球始终呈内斜视(图2)，无其他神经功能障碍征象。

Figure 2 Eye ball position after abducens nerve injury 展神经损伤后眼球位置

2.2 BrdU阳性细胞计数 对照组双侧展神经核及实验组健侧展神经核内BrdU免疫荧光反应为阴性。实验组各组中4只犬抽取展神经核头部、体部、尾部切片各1张，每组共12张切片，观察并记录BrdU阳性细胞数。结果表明损伤侧展神经核内BrdU免疫荧光反应均呈阳性。展神经损伤后3 d，展神经核内神经细胞的再生已经开始并且数量达到高峰，损伤后7 d核内新生细胞数量开始减少，28 d时新生细胞明显减少，见图3。

2.3 免疫荧光双标检测结果

2.3.1 nestin/BrdU免疫荧光双标检测 术后各组，对双侧展神经核进行nestin/BrdU免疫荧光双标检测，实验组损伤侧展神经核内可见到nestin/BrdU免疫荧光双标阳性的神经前体细胞(图4)，而对照组双侧展神经核及实验组健侧展神经核内未见到nestin/BrdU免疫荧光双标阳性的细胞，展神经损伤后展神经核内出现了具有再生潜能的神经前体细胞。

2.3.2 DCX/BrdU免疫荧光双标检测 术后各组，对双侧展神经核进行DCX/BrdU免疫荧光双标检测，实验组损伤侧展神经核内可见DCX/BrdU免疫荧光双标阳性的新生神经元前体细胞(图5)，而对照组双侧展神经核及实验组健侧展神经核内未见到DCX/BrdU免疫荧光双标阳性的细胞。展神经损伤后展神经核内出现的神经前体细胞，可能具有向神经元分化的能力。

2.3.3 GFAP/BrdU免疫荧光双标检测 术后各组，对双侧展神经核进行GFAP/BrdU免疫荧光双标检测，实验组损伤侧展神经核内可见GFAP/BrdU免疫荧光双标阳性的新生星形胶质细胞(图6)，而对照组双侧展神经核及实验组健侧展神经核内未见到GFAP/BrdU免疫荧光双标阳性的细胞。这一部分的阳性细胞可能是由损伤后胶质增生而来，也可能是展神经损伤后由展神经核内出现的神经前体细胞分化而来。

Figure 3 Number of newborn cells at different time points after abducens nerve injury 展神经损伤后记录的不同时间点新生细胞数的变化规律

Figure 4 The neural progenitor cells in the abducens nucleus after abducens nerve injury were detected by Nestin(green)/BrdU(red)immunofluorescence.Nestin/BrdU double positive neural progenitor cells were found in the abducens nucleus after abducens nerve injury(Arrow).A:Nestin immunofluorescence staining;B:BrdU immunofluorescence staining;C:Confocal merge images of A and B Nestin(绿)/BrdU(红)免疫荧光双标检测损伤侧展神经核内神经前体细胞，损伤侧展神经核内出现Nestin/BrdU免疫荧光阳性神经前体细胞(箭头)。A:Nestin免疫荧光染色;B:BrdU免疫荧光染色;C:A、B共聚焦合并图像

Figure 5 The newborn neuronal progenitor cells in the abducens nucleus after abducens nerve injury were detected by DCX(green)/BrdU(red)immunofluorescence.DCX/BrdU double positive newborn neuronal progenitor cells were found in the abducens nucleus after abducens nerve injury(Arrow).A:DCX immunofluorescence staining;B:BrdU immunofluorescence staining;C:Confocal merge images of A and B DCX(绿)/BrdU(红)免疫荧光双标检测损伤侧展神经核内新生神经元前体细胞，损伤侧展神经核内出现DCX/BrdU免疫荧光阳性新生神经元前体细胞(箭头)。A:DCX免疫荧光染色;B:BrdU免疫荧光染色;C:A、B共聚焦合并图像

Figure 6 The newborn astrocytes in the abducens nucleus after abducens nerve injury were detected by GFAP(green)/BrdU(red)immunofluorescence.GFAP/BrdU double positive newborn astrocytes were found in the abducens nucleus after abducens nerve injury(Arrow).A:GFAP immunofluorescence staining;B:BrdU immunofluorescence staining;C:Confocal merge images of A and B GFAP(绿)/BrdU(红)免疫荧光双标检测损伤侧展神经核内新生星形胶质细胞，损伤侧展神经核内出现GFAP/BrdU免疫荧光阳性星形胶质细胞(箭头)。A:GFAP免疫荧光染色;B:BrdU免疫荧光染色;C:A、B共聚焦合并图像

3 讨论

展神经损伤是神经外科、眼科、五官科常见的并发症，另外经静脉系统的岩下窦造影术、海绵窦手术介入过度填塞静脉也常常引起展神经损伤［7］。展神经损伤后可引起眼球向外运动障碍出现内斜视、复视等症状，目前对于展神经损伤后除针对病因进行治疗外，尚无很好的康复治疗方法。因此对展神经损伤后神经修复的临床探索和基础研究显得尤为重要。

展神经在组织学上仅被1～2层髓鞘细胞包绕，缺乏神经外膜、基底膜和牢固的神经束膜包被，胶原蛋白含量明显也低于其他周围神经，且缺少用于连接神经束的结缔组织，给修复和重建带来一定困难［7-8］。目前关于展神经损伤后是否具有一定自我再生修复能力尚未见报道。本研究观察到，犬展神经损伤后(1～28 d)，损伤侧展神经核内有nestin/ BrdU免疫荧光双标阳性的神经前体细胞，而且有新生的DCX/BrdU免疫荧光双标阳性的神经元前体细胞以及GFAP/BrdU免疫荧光双标阳性的星形胶质细胞。本研究表明展神经损伤后，具有一定的自我再生能力，出现的神经前体细胞能够向神经元以及星形胶质细胞分化，这些新生的细胞可能参与了展神经的再生过程。以往研究发现前庭神经和动眼神经损伤后3 d，前庭神经核和动眼神经核内神经再生出现高峰，前庭神经损伤后28 d时新生神经细胞明显减少，而动眼神经损伤后14 d和28 d时，新生神经细胞的数量出现由增多到减少的现象［9-10］。我们研究表明:展神经损伤后，展神经核内也存在新生神经细胞，损伤后3 d，展神经核内神经细胞的再生已经开始并且数量达到高峰，新生细胞数量在7 d时开始逐渐减少，28 d时新生神经细胞明显减少。我们认为不同实验神经细胞再生在时间周期上出现的差异与实验使用的动物及神经的成分有密切的关系。

在临床中我们发现展神经损伤后部分患者不经治疗，也能稍有好转，结合我们实验的结果分析可能与展神经损伤后展神经核内神经细胞再生有关，但实验显示新生细胞数量有限，限制了其自我修复的能力，所以大多数患者不能恢复到正常状态。实验证明了展神经损伤后展神经核内存在新生神经细胞，且可以分化为神经前体细胞、神经元和神经胶质细胞，表明神经细胞是可以再生的，为展神经功能修复等相关研究领域开辟了新的道路。神经系统是人体重要的组成部分之一，损伤神经的再生修复一直是研究热点。而无论是中枢神经系统，还是周围神经系统，损伤神经的再生受到多种因素的影响［11-13］，如何刺激展神经核内再生神经细胞的数量增加，诱导其分化，以便更好地帮助展神经损伤后功能的恢复是我们下一步的研究重点。

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