虾青素对四氯化碳诱导的慢性肝损伤大鼠的保护作用

黄铁军，余琼华，戴列军

·实验性肝炎·

虾青素对四氯化碳诱导的慢性肝损伤大鼠的保护作用

黄铁军，余琼华，戴列军

目的探讨虾青素对慢性肝损伤大鼠肝功能的保护作用。方法采用四氯化碳（CCl4）制备大鼠慢性肝损伤模型，设正常组、模型组、虾青素干预组。通过酶联免疫法测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、总蛋白（TP）以及肝组织超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽转移酶（glutathione-S-transfcrase，GST）活性、谷胱甘肽（glutathione，GSH）及丙二醛（malondialdehyd，MDA）水平。对肝组织病理切片行Masson三色染色，检测肝纤维化情况，采用RT-PCR法检测Ⅰ型胶原mRNA水平。结果正常组大鼠肝胶原指数为（0.42±0.12），模型组大鼠肝胶原指数为（1.84±0.24，P＜0.01），虾青素治疗组肝胶原指数为（0.89±0.12）,显著低于模型组（P＜0.05）；正常大鼠肝组织Ⅰ型胶原mRNA水平为（0.12±0.02），模型组为（0.48± 0.06，P＜0.01），虾青素治疗组为（0.35±0.09），明显低于模型组（P＜0.05）；正常组肝组织MDA、GST、GSH和SOD水平分别为（1.93±0.76）nmol/mg、（18.43±5.34）U/mg、（75.45±9.67）mg/g、（678.80±76.56）U/mg，模型组MDA和GST分别为（6.56±1.09）nmol/mg、（54.34±7.65）U/mg，均显著升高（P＜0.05），而GSH为（35.45±9.01）mg/g，SOD为（203.89±89.00）U/mg，均显著降低（P＜0.01）；与模型组比，虾青素治疗组MDA为（3.34±1.12）nmol/mg，GST为（30.89±4.78）U/mg，均显著低于模型组（P＜0.01），而GSH为（56.78±7.78）mg/g，SOD为（432.34±92.56）U/mg，均较模型组显著升高（P＜0.01）。结论虾青素可以缓解四氯化碳诱导的大鼠慢性肝损伤，其可能机制与提高抗氧化能力有关。

慢性肝损伤;虾青素;氧化应激；保护作用

虾青素（Astaxanthin）又名虾黄质，或龙虾壳色素，化学名称为3，3'-二羟基-4，4'-二酮基-β，β'胡萝卜素。虾青素主要存在于海洋动植物中，特别是在水生的蟹、鱼虾和鸟类的羽毛中。因其化学结构中存在共轭双键链的末端，还有不饱和的酮基和羟基，而酮基和羟基又构成α-羟基酮，该物质具有较为活泼的电子效应，能通过吸引自由基或向自由基提供电子，从而具有较强的清除自由基能力和抗氧化能力。本研究采用四氯化碳致大鼠慢性肝损伤模型，探讨天然虾青素对慢性肝损伤的治疗疗效以及对氧化应激的影响，为应用虾青素保护慢性肝损伤的作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要药物和试剂成年健康清洁级雄性SD大鼠30只，体质量180～220g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供。四氯化碳（CCl4，批号：130710，天津化学试剂研究所）；兔抗Ⅰ型胶原多克隆抗体（批号：201211，武汉博士德生物技术有限公司产品）；Masson染色试剂盒（批号：120810，上海博谷生物）；检测ALT、AST、ALP、TP试剂盒（批号：201235，南京建成生物工程研究所）；天然虾青素（批号：201201，荆州市天然虾青素有限公司）；检测SOD、GSH、MDA、GST试剂盒（批号：201103，南京建成生物工程公司）；检测ⅢPC、LN、Ⅳ-C和HA（批号：201304，北京热景生物技术有限公司）。

1.2 动物分组和模型制备所有动物自由进食和饮水，在适宜的温度和湿度下饲养，光明与黑暗各12小时循环。将30只动物随机分成正常对照组、慢性肝损伤组和虾青素干预组。实验组大鼠先予后肢内侧皮下注射50%四氯化碳/花生油溶液0.2 mg/100 g，2次/ w。左右腿交叉注射，共6 w，建立大鼠慢性肝损伤模型。正常对照组动物予以相同剂量的生理盐水注射。在虾青素干预组，于建模结束后给予400 mg·kg-1虾青素灌胃，正常对照组和慢性肝损伤模型组予以相同剂量的生理盐水灌胃,干预时间为2 w。

1.3 血指标检测采用化学比色法检测肝组织超氧化物歧化酶、谷胱甘肽转移酶活性，及谷胱甘肽和丙二醛水平；采用化学比色法检测血生化指标。

1.4 肝组织学检查在实验结束时，大鼠禁食水，称体质量。处死动物，取肝脏和血，称肝质量，计算肝指数，肝指数=肝质量/体质量×100%。采用Masson染色，随机选取10个高倍视野，应用Image-Pro Plus 6.0软件计算胶原阳性面积占整个视野面积的百分比，即胶原指数；采用RT-PCR法检测肝组织I型胶原mRNA，即取100毫克大鼠肝组织，采用TRIzol法抽提RNA，总反应体系20μL，42℃水浴1h，合成第一链cDNA。取上述逆转录产物1μL作为反应模板，反应体系为25μL。I型胶原Forward：5'-TACAGCACGCTTGTGGGATG-3'；Reverse：5'-TTGAGTTTGGGTTGTTGGTC-3'，进行扩增。同法扩增GAPDH作为内参照。以5μL PCR产物在凝胶上电泳，摄像，存入计算机，并作图像分析。

1.5 统计学分析应用SPSS 17.0统计软件，计量资料以（）表示，多组间均数的比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况正常对照组大鼠生长状况良好；慢性肝损伤大鼠一般情况差，精神萎靡，皮毛光泽度欠佳，体质量增长速度明显减慢，肝指数明显升高；虾青素干预组大鼠体质量增长较正常对照组稍缓慢，肝指数亦明显升高，但明显低于模型组（P＜0.05）。虾青素干预组与模型组间体质量和肝质量差异无统计学意义（表1）。

表1 大鼠体质量和肝指数（）的比较

表1 大鼠体质量和肝指数（）的比较

与正常组比，①P＜0.05；与模型组比，②P＜0.05

例数体质量（g）肝质量（g）肝/体比值正常组10247.00±7.689.60±1.083.56±0.25模型组10323.23±8.87①12.33±1.87①4.87±0.30①虾青素10289.43±15.4510.43±3.453.90±0.34②

2.2 肝组织病理学表现正常大鼠仅在汇管区和中央静脉区见少量的胶原纤维，肝胶原指数为（0.42±0.12）；肝损伤模型大鼠肝内形成弥散的致密性纤维组织，肝小叶结构紊乱，伴大小不一的亚假小叶结构，肝胶原指数为（1.84±0.24），与正常对照相比，胶原指数明显增加（P＜0.01）；与模型组比，虾青素处理组动物肝内亚假小叶结构明显减少，肝胶原指数为（0.89±0.12）,肝内胶原沉积明显减少，且小叶结果紊乱程度减轻（图1～3）。此外，还发现正常组大鼠肝组织无细胞变性，而模型组肝组织脂肪变性较为明显，经虾青素处理后脂肪变性减轻。

2.3 血生化指标的变化与模型组大鼠相比，虾青素干预组血生化指标明显降低（P＜0.05，表2）。

2.4 肝组织Ⅰ型胶原mRNA水平比较正常肝组织Ⅰ型胶原mRNA水平为（0.12±0.02），模型组为（0.48± 0.06），显著高于正常组（P＜0.01）；与模型组比，虾青素处理组（0.35±0.09）明显降低（P＜0.01），图4。

2.5 大鼠肝组织氧化应激指标的变化与正常组比较，模型组大鼠肝组织GST活性和MDA水平显著升高（P＜0.05），而SOD活性和GSH水平显著降低（P＜0.01）；与模型组大鼠相比，虾青素干预组肝组织MDA水平和GST活性显著降低（P＜0.01，表3）。

图1 正常对照组肝小叶结构完整，无细胞变性坏死，无炎性细胞浸润及无胶原沉积（Masson，200×）

图2 模型组肝小叶结构破坏，细胞变性严重，明显的脂肪变，炎性细胞浸润及胶原增生严重（Masson，200×）

图3 虾青素处理组肝小叶结构破坏减轻，细胞变性较少，较少炎性细胞浸润及较轻的胶原增生（Masson，200×）

图4 各组大鼠肝组织Ⅰ型胶原mRNA水平比较与正常组比，①P＜0.01；与模型组比，②P＜0.01

表2 各组大鼠血生化指标（）的比较

表2 各组大鼠血生化指标（）的比较

与正常组比,①P＜0.01；与模型组比，②P＜0.01

例数AST（U/L）ALT（U/L）ALP（U/L）TP（g/L）正常组10140.4±16.743.7±7.089.9±9.674.4±10.0模型组10323.3±65.6①98.9±9.8①197.9±34.9①72.2±9.1干预组10200.9±43.8②70.5±8.8②156.9±12.8②69.9±8.9

表3 各组大鼠氧化应激指标（）的比较

表3 各组大鼠氧化应激指标（）的比较

与正常组比,①P＜0.05，②P＜0.01；与模型组比，③P＜0.01

例数MDA（nmol/mg）GST（U/mg）GSH（mg/g）SOD（U/mg）正常组101.93±0.7618.43±5.3475.45±9.67678.80±76.56模型组106.56±1.09①54.34±7.65①35.45±9.01②203.89±89.00②虾青素103.34±1.12③30.89±4.78③56.78±7.78③432.34±92.56③

3 讨论

慢性肝损伤是机体在应对各种生物或者非生物等致病因子刺激过程中所致肝实质细胞和非实质细胞受损。若致病因子长时间存在，会导致肝细胞变性、坏死，甚至肝组织内胶原沉积，导致肝纤维化,最终可以导致肝功能障碍，甚至肝衰竭[1，2]。在慢性肝损伤发生发展过程中，存在诸多的病理生理方面的改变，其中氧化应激在慢性肝损伤的发生发展进程中起着不容忽视的作用[3～5]。在生理情况下，机体氧化应激和抗氧化应激系统处于稳态平衡状态，即体内产生以MDA为代表的氧自由基形成和脂质过氧化反应的终末产物，以及以还原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶为代表的保护性抗氧化物质，使之处于动态平衡状态。在慢性肝损伤过程中，这种平衡被打乱，导致氧化损伤[6～8]。

采用合适的动物模型研究慢性肝损伤至关重要。本实验采用四氯化碳诱导慢性肝损伤模型，该模型具有重复性好和成功率高等优点[9]。在不同方法建立的动物模型，其慢性肝损伤形成的机制不同。在四氯化碳诱导的慢性肝损伤，其主要机制是CCl4通过细胞色素氧化酶代谢为活性氧三氯甲基[10]。过多活性氧超出了体内抗氧化物的清除能力，使氧化系统和抗氧化系统之间的动态平衡被打破，最终导致肝脏损伤[11]。该实验在造模过程中通过对其氧化应激相关指标检测，发现模型组大鼠肝组织GST活性和MDA水平显著升高，而SOD活性和GSH水平显著降低，这一结果恰恰也证实氧化应激在慢性肝损伤中发挥着重要作用。

慢性肝损伤在肝脏形态结构以及功能上有一定的反映。在形态上，可出现肝脏脂肪变性、坏死，若慢性损伤持续存在，可导致肝纤维化[12～14]；在功能上，反映出相关血清酶升高和合成功能障碍。本实验中，慢性肝损伤模型大鼠肝脏出现细胞变性，其中脂肪变性尤为明显。另外，还出现了肝纤维化。在肝功能受损方面，表现出丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶明显升高。在经过虾青素干预后，慢性肝损伤大鼠肝脏脂肪变性好转，肝纤维化面积、Ⅰ型胶原mRNA水平降低。同时，反应肝功能受损的丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶也降低，说明虾青素可能抑制了慢性肝损伤的发展。实验还发现虾青素可明显降低肝组织MDA和GST水平，提高GSH水平和SOD活性，提示其具有抗氧化能力。虾青素作为自然界存在的一种具有高度活性的化合物，其抗氧化性能主要表现在淬灭单线态氧，清除自由基，降低膜的流动性，稳定膜结构，增加抗氧化酶的活性，抑制脂质过氧化等方面[15]。我国学者亦发现虾青素对肝损伤具有保护作用，而且这种保护作用主要与增强氧化应激有关[16～18]。此外，我国学者对虾青素在不同疾病中的作用进行了研究，不断深究其药理机制。曹秀明发现虾青素对过氧化氢所致HepG2细胞线粒体氧化损伤具有明显的保护作用[19]；虾青素对骨关节炎软骨细胞的氧化损伤，具有研发成为治疗药物的潜能[20]；虾青素具有潜在的维持内皮功能的作用。上述虾青素的药理作用机制正是通过不同机制减轻氧化应激损伤的[15]。综上所述，虾青素对慢性肝损伤具有保护作用,该作用可能与虾青素抗氧化有关。

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（收稿：2013-12-27）

（校对：陈从新）

Protective effect of astaxanthin on CCl4-induced chronic liver injury in rats

Huang Tiejun，Yu Qionghua，Dai Liejun Department of Infectious Diseases，School of Clinical Medicine，College of Science and Technology，Xianning 437100，Hubei Province，China

ObjectiveTo investigate the effects of astaxanthin on chronic liver injury in rats and to explore the underlying mechanism.MethodsChronic liver injury in rats were induced by carbon tetrachloride injection，and the rats were randomly divided into control，model and astaxanthin group.The content of ALT，AST，ALP，TP in serum andsuperoxide dismutase（SOD），glutathione-S-transfcrase（GST），glutathione（GSH）and malondialdehyd（MDA）in liver tissues were detected.The collagensⅠmRNA were detected by RT-PCR.ResultsThe collagens index in model group were（1.84±0.24），much higher than in control[（0.42±0.12），P＜0.05]，while the collagens index in astaxanthin group（0.89±0.12）decreased significantly（P＜0.05）as compared to that in the model; The collagenⅠmRNA in model group（0.48±0.06）was higher than in control group（0.12±0.02），while it decreased（0.35±0.09）in astaxanthin group（P＜0.01）as compared to that in the model；In control group，the MDA，GST，GSH and SOD in liver tissues were（1.93±0.76）nmol/mg，（18.43±5.34）U/mg，（75.45±9.67）mg/g and（678.80±76.56）U/mg，respectively.They were（6.56±1.09）nmol/mg，（54.34±7.65）U/mg，（35.45±9.01）mg/g and（203.89±89.00 U/mg），respectively.After treatment of astaxanthin，they were（3.34±1.12）nmol/mg，（30.89±4.78）U/ mg，（56.78±7.78）mg/g and（432.34±92.56 U/mg），respectively.Conclusion Astaxanthin could attenuate chronic liver injury in rats by improving the anti-oxidative stress.

Chronic liver injury；Astaxanthin；Protective effect；Oxidative stress

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.02.018

437100湖北省咸宁市湖北科技学院临床医学院传染病学教研室

黄铁军，男，35岁，讲师。E-mail：277872390@qq.com