经肝动脉自体骨髓或脐带血干细胞移植治疗失代偿期肝硬化患者的安全性和近期疗效比较*

王方，云升皓，周新人，寇俊峰，蔡国芳，陈瑞丽，杨兴坤，张静，冯淑贤

·肝硬化·

经肝动脉自体骨髓或脐带血干细胞移植治疗失代偿期肝硬化患者的安全性和近期疗效比较*

王方，云升皓，周新人，寇俊峰，蔡国芳，陈瑞丽，杨兴坤，张静，冯淑贤

目的比较经肝动脉途径注入自体骨髓干细胞或脐带血干细胞治疗失代偿期肝硬化患者的安全性，以及对患者肝功能和凝血酶原活动度的近期改善作用。方法选择失代偿期肝硬化患者65例，随机分为骨髓组33例和脐血组32例；骨髓组患者经股动脉插管至肝固有动脉注入自体骨髓干细胞移植治疗，脐血组经同样途径注入脐带血干细胞治疗；治疗后8周检测血清谷丙转氨酶、总胆红素、凝血酶原活动度、白蛋白和甲胎蛋白水平变化，同时观察临床症状的改善情况及术后的不良反应。结果治疗后第3天两组患者乏力、纳差症状均有改善，两组间差异无显著性。治疗后8w，骨髓组和脐血组白蛋白水平分别由（31.0±4.6）g/L上升至（34.6±7.1）g/L和由（34.6±7.1）g/L上升至（37.8±8.3）g/L，凝血酶原活动度上升由（48.8±13.4）%上升至（55.5±11.2）%和由（47.5±12.5）上升至（58.9±14.0）%，但两组间改善程度的差异无显著性；在治疗8w末血清谷丙转氨酶、总胆红素和甲胎蛋白在骨髓组分别为（45.6±12.3）IU/L、（28.1±13.5）μmol/L和（11.3±4.1）μg/L，在脐血组分别为（47.2±11.8）IU/L、（30.7± 14.8）μmol/L和（9.8±3.5）μg/L，两组间与基础水平相比改善程度的差异也无显著性。结论自体骨髓干细胞或脐带血干细胞经肝动脉途径移植治疗失代偿期肝硬化患者的近期疗效及安全性均良好，但两种细胞治疗的改善水平无显著差异。

肝硬化；自体骨髓干细胞；脐带血干细胞；细胞移植；疗效

目前，干细胞在医学领域内的应用越来越令人瞩目，也为失代偿期肝硬化患者的治疗提供了新的方法。已有的干细胞治疗的报道多采用自体骨髓干细胞、脐血干细胞、外周造血干细胞等，在临床上取得了一定的效果[1～10]。有研究报道脐血内干细胞数量和质量较骨髓内更为优越，更具有自我更新、增殖分化和体外扩增的潜能[11～20]。本文比较了自体骨髓干细胞和脐带血干细胞经肝动脉注入肝内治疗失代偿期肝硬化患者的近期疗效，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 病例选择2006年12月至2012年5月在我科住院的失代偿期乙型肝炎肝硬化患者65例，男42例，女23例；年龄34～60岁，平均年龄（42.2±4.5）岁。

诊断均符合2010年中华医学会发布的《慢性乙型肝炎防治指南》。肝功能分级属于Child-Pugh B/C级。无感染和原发性肝癌等并发症。将患者随机分为自体骨髓干细胞治疗组33例和脐带血干细胞治疗组32例。两组患者基线指标无显著性差异。

1.2 基础治疗两组在治疗前或在治疗的同时已经开始接受核苷类药物抗病毒治疗。给予两组患者谷胱甘肽（古拉定，意大利斯德大药厂）1.2g，加入5%葡萄糖注射液100ml中静脉滴注，1次/d，门冬氨酸钾镁注射液30ml、维生素C 3.0，加入10%葡萄糖注射液250ml中静脉滴注，1次/d。

1.3 术前准备及干细胞分离与治疗患者在术前

签署自体骨髓干细胞或脐带血干细胞治疗知情同意书，做好心理护理，减轻患者的紧张和恐惧心理。双侧腹股沟备皮，行碘过敏试验。在无菌条件下，选择两侧髂后上棘为穿刺点，消毒、局部麻醉，以18号骨髓穿刺针穿刺，抽取骨髓血160～190 ml，肝素抗凝。在妇产科医生的协助下选择HBsAg、抗HCV、抗HIV和抗梅毒螺旋体抗体阴性的健康产妇，在孕妇分娩后马上取其脐带血60～100 ml，配血型，与患者血型相同。应用宁夏中联达生物有限公司生产的细胞分离试剂盒分离干细胞，将脐带血转移至A液瓶内，加入B液，充分混匀，室内静置约20～30 min，观察到A液瓶内有明显的红细胞沉降层后，将上清液转移至50 ml离心管中，2500 r/m离心5 min，弃去上清液，每管加注生理盐水，最后收集在一个50 ml离心管中。取2支新的50 ml离心管，各加入25 ml C液，将收集到的细胞悬液加入到含有25 ml C液的离心管中，1800 r/m离心30 min。仔细地吸取中间云雾状细胞层。加生理盐水至50 ml，2500 r/m离心5 min，弃去上清液，加入生理盐水，混匀，1800 r/m离心5 min，如此共洗涤3次，最后弃去上清液，适量稀释存在于离心管最底部的细胞，保存于5 ml试管中。取100 μl细胞悬液进行细胞计数。本组分离的脐带血干细胞数目在1～5×107之间。在放射介入条件下，经股动脉插管至肝固有动脉，将分离好的细胞悬液注入肝内，穿刺点处加压包扎，术后术侧下肢制动8h，3d内避免过度运动。预防性应用头孢唑林2g/12h，静脉滴注，连用3d。

1.4 临床检测采用速率法检测肝功能（广州标佳公司）；采用雅培公司提供的原装试剂检测凝血功能指标；采用放射免疫法检测AFP（北京北方生物试剂研究所）。

1.5 统计学处理应用SPSS16.0软件进行统计分析。计量资料以（）表示，组间比较用成对资料的t检验，计数资料采用x2检验，P＜0.05为统计学上有显著性差异。

2 结果

2.1 患者自觉症状改善情况在治疗后第3天，两组全部患者乏力、纳差症状有改善，两组间差异无显著性（P＞0.05）。

2.2 肝功能和PTA改善情况如表1所示，在治疗后8w，骨髓细胞和脐血细胞移植患者肝功能指标无显著性差异（P＞0.05）。

2.3 不同Child-Pugh分级患者治疗前后肝功能指标的变化情况见表2和表3。

2.4 不良反应两组均未发现明显的不良反应及并发症。

表1 两组患者肝功能和AFP（）的比较

表1 两组患者肝功能和AFP（）的比较

与骨髓干细胞移植组比，①P＞0.05

例数ALB（g/L）PTA（%）ALT（IU/L）TBIL（μmol/L）AFP（μg/L）骨髓33治疗前27.5±6.348.8±13.450.4±11.130.6±14.710.±4.7治疗后34.6±7.155.5±11.245.6±12.328.1±13.511.3±4.1脐血32治疗前26.6±8.047.5±12.552.5±10.734.4±15.28.2±3.9治疗后37.8±8.3①58.9±14.0①47.2±11.8①30.7±14.8①9.8±3.5①

表2 两组Child-Pugh B级患者肝功能指标（）的比较

表2 两组Child-Pugh B级患者肝功能指标（）的比较

与骨髓干细胞移植组比，①P＞0.05

例数ALB（g/L）PTA（%）ALT（IU/L）TBIL（μmol/L）骨髓23治疗前31.0±4.660.2±7.649.0±11.324.9±13.1 8 w后37.6±6.966.0±7.440.8±13.020.8±12.9脐血24治疗前8 w后30.8±4.4 39.3±7.6①61.1±7.9 67.3±8.2①50.0±12.8 43.7±12.5①23.0±12.8 21.3±13.7①

表3 两组Child-Pugh C级患者肝?功能指标（）的比较

表3 两组Child-Pugh C级患者肝?功能指标（）的比较

与骨髓干细胞移植组比，①P＞0.05

例数ALB（g/L）PTA（%）ALT（IU/L）TBIL（μmol/L）骨髓10治疗前24.6±4.850.5±7.454.6±14.339.1±11.0 8 w后29.5±7.151.9±7.452.3±14.033.0±14.1脐血8治疗前8 w后23.2±4.4 33.2±6.4①51.9±6.0 54.0±8.0①53.9±14.1 51.8±15.1①42.0±12.4 32.3±14.1①

3 讨论

失代偿期肝硬化是慢性肝病的终末期状态，在我国发病率高，危害严重，目前临床上缺乏特异的治疗方法。如何改善终末期肝病患者的肝功能成为临床治疗的难点和热点。近年来，随着干细胞技术和再生医学的发展，以干细胞为基础的细胞治疗为失代偿期肝硬化患者提供了新的治疗方法。干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，在一定的条件下可以分化为各种功能细胞，发挥修复组织器官的作用。

目前，有关干细胞治疗失代偿期肝硬化患者的报道较多，且取得了较好的疗效。已有的报道多采用自体骨髓干细胞、脐血干细胞、外周血造血干细胞等[1～10]。与骨髓和外周血干细胞相比，脐带血干细胞具有更强的增殖分化能力，其免疫原性弱，移植物抗宿主病发生率低，无肿瘤细胞污染，从配型到获得细胞时间短，成本低廉，而且脐血在基础科研及临床运用中较少涉及社会伦理和法律问题[11]。由于这些优点，使脐血在移植研究中作为一种特别的细胞资源，备受关注。

据报道脐带血所含干细胞在数量和质量上明显优于骨髓血所含干细胞。目前发现脐带血中的干细胞有造血干细胞和间充质干细胞[12～14]。大量实验已经证实脐带血造血干细胞比骨髓和动员的外周血来源的造血干细胞更原始、更具有自我更新、增殖分化和体外扩增潜能。周汉超等[15]报道分离后的脐血干细胞的CD34和CD38数量明显多于骨髓血干细胞。据报道脐带血中的CD34+细胞所占比例与骨髓相似，但在质量上，在体外长期培养的脐血CD34+细胞中CD34+CD45+细胞明显高于骨髓，CD34+CD38-和CD34+CD33-细胞在脐血中的比例均高于骨髓，而且脐血CD34+CD38-细胞的增殖分化能力高于骨髓[17，18]。存在于脐血中CD34+CD38-细胞群可以再动员SCID小鼠的免疫细胞，使之部分恢复细胞免疫功能[19]。此外，脐带血中造血干/祖细胞的数量及增殖能力也均高于骨髓[20]。这些原因可能就是为什么使用少量的脐带血来分离干细胞要比抽取大量的骨髓分离细胞来的经济、实用。

有报道脐血干细胞治疗后患者临床症状和体征改善明显高于骨髓干细胞治疗后[15]，但也有报道显示两组患者治疗效果相似，无显著性差异[16]。本研究使用脐带血和骨髓血干细胞治疗患者65例，比较两组发现在疗效方面无显著性差异，两组在临床上均取得了较好的疗效，在临床症状改善方面两组间相似，脐血组在生化指标改善方面优于骨髓组，除了AST在脐血组的下降较骨髓组有显著性差异外，余项指标脐血组均优于骨髓组，但两组间无显著性差异。不同的研究者报道的疗效间有所差异，可能与选取的患者特征、抽取的骨髓量、脐血量、细胞分离的方法、所得细胞数量和观察时间点等因素不同有关。总体来讲，脐血干细胞治疗的疗效较骨髓干细胞治疗有优势，这与上述基础研究的结果是一致的。因骨髓穿刺有创伤，且年龄大的肝病患者骨髓质量较差，所以对于年龄大于40岁以上的患者行脐带血干细胞治疗可能会更获益。

本研究显示，脐带血和骨髓血干细胞治疗后患者血清白蛋白水平和凝血酶原时间均有明显的改善，说明注入肝脏的干细胞发挥了修复病损肝脏的功能，使肝脏的合成功能有了不同程度的改善。干细胞在肝脏内如何发挥作用，其具体的机制尚不清楚，推测可能的机制是干细胞进入肝脏后在肝脏的微环境中分化为实质肝细胞，或是进入肝脏的干细胞分泌一些细胞因子而促进肝细胞的再生。干细胞能够产生重要的细胞-细胞接触和支持造血的生长因子，还能通过诱导“归巢”受体将干细胞融合入肝脏，进而使干细胞转化为肝样细胞而发挥作用，这是需要进一步研究和探讨的问题。

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（收稿：2013-12-30）

（校对：陈从新）

Safetyandshort-termefficacyofautologousbonemarroworumbilicalcordbloodstemcells

transplantation through hepatic artery in treatment of patients with decompensated cirrhosis

Wang Fang,

Yun Shenghao，Zhou Xinren，et al.Department of Infectious Diseases，Anning Branch of General Hospital,Lanzhou Military Area Command，Lanzhou 730070，Gansu Province，China

ObjectiveTo investigate the safety of autologous bone marrow stem cells or umbilical cord blood stem cells transplantation in treatment of patients with decompensated cirrhosis through hepatic artery and the improvement in liver function and prothrombin activity in a short term.MethodsSixty-five patients with decompensated cirrhosis were randomly divided into bone marrow group（33 cases）and umbilicus cord blood group（32 cases）；patients in bone marrow group received autologous bone marrow stem cells transplantation through hepatic artery and the umbilicus cord blood group received umbilical cord blood stem cells through the same way；thechangesofserumalanineaminotransferase，totalbilirubin，prothrombinactivity，albuminandalphafetoprotein after 8 weeks were determined，and the improvement in symptoms and postoperative adverse reactions wereobserved.ResultsThreedaysaftercelltransplantation，patientsinbothgroupsachievedsignificantly improvement in symptom such as fatigue and anorexia but had no significantly difference between the two groups. At eight weeks post therapy，in patients of bone marrow group and umbilicus group，serum albumin level increased significantly from the baseline of（31.0±4.6）g/L to（34.6±7.1）g/L and（26.6±8.0）g/L to（37.8±8.3）g/L，prothrombin activity from（48.8±13.4）%to（55.5±11.2）%and（47.5±12.5）to（58.9±14.0）%，but the improvement did not differ between the two groups；alanine aminotransferase，total bilirubin and alpha-fetoprotein were（45.6±12.3）IU/L，（28.1±13.5）μmol/L and（11.3±4.1）μg/L respectively in patients of bone marrow group and（47.2±11.8）IU/L，（30.7±14.8）μmol/Land（9.8±35）μg/Lrespectivelyinpatientsof umbilicalgroupat8weeksposttherapy，butthe improvement did not differ between groups.ConclusionsIt issafeandeffectiveintreatmentofpatientswithdecompensated cirrhosis using autologous bone marrow stem cells and umbilical cord blood stem cells transplantation through hepatic artery and no significant difference was observed between the two group.

Cirrhosis；Autologousbonemarrowstemcells；Umbilicalcordbloodstemcells；Cell transplantation；Efficacy

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.04.006

甘肃省科技支撑计划项目（编号：0708NKCA093）

730070兰州市兰州军区总医院安宁分院感染病科（王方，云升皓，周新人，寇俊峰，蔡国芳，陈瑞丽，杨兴坤，张静）；妇产科（冯淑娴）

王方，女，44岁，医学博士，主任医师。主要研究方向为慢性肝病的发病机理和治疗学研究。E-mail：kaixin919@163.com