IL-22和SOCS3在3型鼠肝炎病毒诱导的小鼠慢性病毒性肝炎发病中的作用探讨*

李咏，陆玉蕾，吴婷，韩梅芳，宁琴

·实验性肝炎·

IL-22和SOCS3在3型鼠肝炎病毒诱导的小鼠慢性病毒性肝炎发病中的作用探讨*

李咏，陆玉蕾，吴婷，韩梅芳，宁琴

目的探讨鼠3型肝炎病毒（MHV-3）诱导的慢性病毒性肝炎C3H/Hej小鼠肝组织白细胞介素-22（IL-22）和细胞因子信号抑制因子3（SOCS3）mRNA水平的变化。方法给C3H/Hej小鼠腹腔注射MHV-3（100 pfu），诱导慢性病毒性肝炎模型，采用实时荧光定量PCR法检测MHV-3感染后0、5、10、15和20 d时小鼠肝组织IL-22和SOCS3 mRNA水平的变化。结果模型鼠肝组织IL-22和SOC3 mRNA水平在0 d时分别为（0.26± 0.15）%和（6.35±2.21）%，在感染后10、15和20 d后IL-22水平分别为（6.28±2.79）%、（2.50±1.24）%和（2.73± 0.85）%，SOC3水平分别为（16.92±4.39）%、（14.06±4.09）%和（13.36±1.89）%，均较0 d时显著增高（P＜0.05），且在第10 d达到最高峰。结论IL-22和SOCS3可能参与了MHV-3诱导的小鼠慢性病毒性肝炎的发生发展过程。

鼠3型肝炎病毒；慢性病毒性肝炎；白细胞介素-22；细胞因子信号抑制因子3；小鼠

白细胞介素-22（interleukin-22，IL-22）是IL-10细胞因子家族的一个成员，参与机体早期免疫防御，保护并修复炎症反应造成的组织损伤[1]。IL-22可以由自然杀伤细胞22（NK22）和辅助性T淋巴细胞17/22（Th17/22）等细胞产生[2]。这些细胞需要对T细胞受体（TCR α/β）或外来细胞因子的刺激产生应答才能产生IL-22。例如白细胞介素-9（IL-9）的刺激就可以促进相关细胞分泌IL-22。在感染过程中，IL-22的产生与蛋白酪氨酸激酶家族（JAK1），酪氨酸激酶2（TYK2）信号通路激活有关。在这一过程中，JAK1和TYK2首先被磷酸化，信号转导因子和转录激活因子3（STAT3）和信号转导因子和转录激活因子1（STAT1）被激活，磷酸化的STAT1和STAT3入核，诱导特定基因的表达[4]。IL-22行使其功能主要通过与受体结合，并被运送至靶细胞而发挥作用，同时IL-22可以通过协同效应作用于IL-17，以共同调节天然免疫相关分子的表达[3]。有研究表明IL-22在消化道、皮肤和呼吸系统的黏膜固有免疫中起重要作用。临床研究发现IL-22在银屑病、异位性皮炎以及溃疡性结肠炎等患者外周血中高表达;与之相反，在急性呼吸窘迫综合征和系统性红斑狼疮患者，血清IL-22水平是下降的。上述这些研究说明IL-22的表达与炎性疾病可能存在一定的关联[1，4]。IL-22的产生需要STAT3的活化，同时由于负反馈通路的存在，细胞因子信号传导抑制分子3（SOCS3）也会出现上调。SOCS3具有负性调节细胞因子信号转导的作用[5]，SOCS3可被多种炎症因子和抗炎因子诱导，这其中就包括IL-22。SOCS3激活后可抑制多种免疫分子的信号传导。在小鼠的相关研究表明，SOCS3也与炎症相关疾病（哮喘、关节炎、炎症性肠病[6～10]）等密切相关。SOCS3是调节细胞信号转导网络的关键蛋白。因此，SOCS3水平异常时可能预示着炎症疾病的发生和发展。

有研究表明，IL-22和SOCS3在炎症性疾病的发展过程中可以相互调节[9]，两者间的相互作用在炎症和组织损伤修复中起到重要作用。目前，关于IL-22和SOCS3在慢性肝损伤中的水平变化及作用的研究还比较少。本研究利用鼠三型肝炎病毒（MHV-3）诱导的小鼠慢性肝损伤模型，研究IL-22和SOCS3的变化情况，以探讨两者在慢性肝损伤发病机制中所起的作用。

1 材料与方法

1.1 病毒株MHV-3病毒株为本研究室保存，注射用MHV-3滴度为1×106pfu/ml。

1.2 慢性肝损伤模型的建立取雌性SPF级C3H/ Hej小鼠（上海实验动物中心），6～8周龄，体质量18～20 g，饲养在本实验室洁净层柜（IVC系统，苏州苏杭科技有限公司）内，恒温、恒湿，自由食水。随机将小鼠分为模型组和对照组，各25只。模型组小鼠腹腔注射含10 pfu MHV-3的生理盐水溶液200 μl，对照组小鼠腹腔注射PBS液200 μl。在注射前（0 d）和注射后第5、10、15、20 d分批收集小鼠肝组织，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片，行苏木精-伊红染色。

1.3 肝组织IL-22和SOCS3 mRNA检测取肝组织30～50 mg，溶解于Trizol 1 ml中，进行碾磨，采用Trizol法提取总RNA。取总RNA 1 μg，逆转录成cDNA。采用南京金斯瑞公司提供的试剂盒行逆转录，加入Oligod T 1μl，双蒸水补足至12 μl，70℃水浴10 min，冰上冷却，再依次加入：逆转录混合缓冲液4 μl，1 mmol/L dNTP 1 μl，RNA酶抑制剂2 μl，37℃水浴5 min，加入逆转录酶1 μl，42℃水浴60 min，70℃灭活10 min，终止反应，将cDNA置于-20℃保存。引物序列如下:鼠GAPDH上游序列：5’-CTCATGACCACAGTCCATGCCATC-3’，下游序列: 5'-CTGCTTCACCACCTTCTTG-3’；鼠IL-22上游序列: 5’-TTGAAATGTCCAATTCCAGCA-3’，下游序列:5’-GCCGGACGTCTGTGTTGTTA-3’；鼠SOCS3上游序列:5’-GCTGGCCAAAGAAATAACCA-3’，下游序列：5’-AGCTCACCAGCCTCATCTGT-3’。PCR反应体系为20 μl，包括上下游引物各1 μl，模板1 μl，SYB 10 μl，加双蒸水补足至20 μl。反应条件为95℃1 min，95℃15 s，60℃15 s，72℃35 s，40个循环。使用日本TOYOBO公司提供的RealTimePCR试剂（QPK201-T），在Applied Bio-systems 7500（ABI美国）仪器上进行目的基因检测。

1.4 统计学分析应用SPSS10.0统计软件，计量资料以（）表示，组间比较采用单因素方差检验，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 慢性病毒性肝炎小鼠模型建立成功小鼠在感染病毒10 d后，肝组织有大量的淋巴细胞和少量的中性粒细胞浸润，肝小叶结构明显破坏，出现肝细胞水肿、气球样变、点状坏死或灶状坏死，甚至碎片样坏死（图1）。

图1 感染MHV-3小鼠肝组织病理学表现（HE，200×）

2.2 肝组织IL-22 mRNA水平变化在MHV-3诱导的C3H/Hej小鼠慢性肝损伤模型中，随着感染时间的延长，小鼠肝组织IL-22 mRNA水平逐渐升高[5、10、15和20 d分别为（0.26±0.15）%、（6.28±2.79）%、（2.50±1.24）%和（2.73±0.85）%]，在感染后第10天达到高峰（图2）。

图2 MHV-3感染C3H/Hej小鼠肝组织IL-22 mRNA水平变化

2.3 肝组织SOCS3 mRNA水平变化在MHV-3诱导的C3H/Hej小鼠慢性肝损伤模型中，肝组织SOCS3 mRNA水平变化见图3。随着感染时间的延长，与0 d比，10、15、20 d小鼠肝脏组织SOCS3 mRNA水平显著升高[（6.35±2.21）%对（16.92±4.39）%、（14.06±4.09）%、（13.36±1.89%），P＜0.05]，在感染后第10 d达到高峰（图3）。

图3 MHV-3感染C3H/Hej小鼠肝组织SOCS3 mRNA水平变化

3 讨论

很多病因都可以引起慢性肝损伤，如病毒性肝炎、药物、酒精中毒和循环障碍等。在我国，病毒性肝炎仍是引起慢性肝损伤的主要原因。在HBV感染所导致的肝损伤中，宿主免疫应答起到非常重要的作用[12]。在病毒感染早期，由免疫效应细胞介导的先天免疫被激活，产生相应的细胞因子，以达到控制病毒的目的，但免疫的激活和大量炎症因子的释放同时也可以引起肝脏损伤。

IL-22是一种重要的细胞因子。IL-22的表达与炎症微环境有关。以往有研究表明IL-22在HBV感染中有一定的作用，但具体机制并不明确[13]。有研究报道IL-22的表达水平可能与ALT有一定的相关性[14]。IL-22水平的紊乱可能在HBV感染所导致的肝损伤中起到重要作用[15]。在我们构建的小鼠慢性肝损伤模型中，小鼠的肝损伤程度在10天时达到高峰，随着感染时间的延长，C3H/Hej小鼠肝脏IL-22 mRNA水平显著上调。有研究表明IL-22可以在某些疾病过程中起促炎作用。在小鼠实验中，诱导产生的IL-22的变化促进了急性期的炎症反应，包括诱导纤维蛋白原、人干扰素诱导蛋白-10（CXCL10）和血清淀粉样蛋白A的产生，同时伴随血小板、中性粒细胞和红细胞计数增加。也有相关报道表明在许多上皮屏障表面，IL-22可预防感染和炎症反应。例如，在IL-22基因敲除的小鼠模型中，肺炎克雷伯杆菌感染可导致小鼠迅速死亡[16]；在小鼠溃疡性结肠炎模型中，IL-22可以降低局部肠道炎症[17]。目前还有其他报道表明，IL-22同时也能调节细胞增殖、存活和组织修复[1]。在我们的研究中，在病毒感染过程中肝组织IL-22水平逐渐升高，并在10天时达到峰值，而肝脏炎症损害也是在10天时最为明显。因此，我们推测，IL-22参与了MHV-3诱导的C3H/Hej小鼠慢性肝炎的发生发展过程，从炎症程度和IL-22的表达峰值时间点来看，我们认为IL-22与炎症程度密切相关。我们推测，在这个过程中，IL-22对慢性肝损伤的作用可能是双重的。一方面，IL-22在病毒感染时被激活而上调，可以诱导其他炎症因子释放，如IL-6、CXCL-10等，促进炎症的发展；而另一面，IL-22也具有组织修复和延缓炎症发生的作用。IL-22自身的表达调控是一个微妙的平衡，以此来控制炎症的发生发展，其具体机制在将来还需进一步深入研究。

IL-22的产生与STAT家族的活化密切相关。SOCS3是可以调节STAT并与炎症相关的重要因子，它作为JAK/STAT通路的负性调控基因被广泛报道[4；5；8]，为了避免过度的免疫应答，SOCS3通过抑制活化的STAT3来调控炎症反应。因此，SOCS3在炎症中的作用至关重要。以往对SOCS3在慢性炎症中作用研究仍存在一定的争议。有研究表明，SOCS3通过抑制IL-6/gp130巨噬细胞起到促炎作用[18，19]。然而，在病理情况下，有相关的证据表明SOCS3能抑制IL-6相关的细胞因子而发挥重要作用。SOCS3对TOLL样信号通路也有调控作用，可以通过调控TLR4信号通路来调控相关炎症分子的释放[20]。

以往有报道IL-22在CD3阳性T细胞表达依赖于STAT3活化。在肝纤维化相关研究也表明，肝损伤后IL-22的诱导需要STAT3激活[17，21]。SOCS3可以抑制STAT3的活化，负性调节JAK/STAT起到调控炎症反应的作用[22]。上述研究表明SOCS3在一定程度上对IL-22有调控作用。目前也有研究表明，过表达SOCS3对IL-22所致的组织再生效应有抑制作用[23]。基于上述研究，我们在MHV-3诱导的小鼠慢性肝损伤模型中同时研究了SOCS3和IL-22表达。我们发现，SOCS3的表达和IL-22是一致的。SOCS3和IL-22在MHV-3感染过程中都升高，并于10天时达到高峰，而感染10天正是这一模型中炎症最明显的时间点。有研究表明IL-22可以上调SOCS3的表达以及相关炎性细胞因子的释放，而激活的SOCS3反过来又可以抑制IL-22表达。在MHV-3诱导的小鼠慢性肝损伤模型中，我们的研究结果与以往研究类似。我们推测IL-22和SOCS3均参与了慢性肝损伤的发生发展。同时在慢性肝损伤中，SOCS3的产生对IL-22有调节作用。在慢性肝损伤中，SOCS3对IL-22的调控可能是通过两个途径实现的。一方面是负性调节STAT3的活化，在一定程度上调控IL-22表达[17，21]；另一方面，Th17细胞是IL-22产生的重要来源之一[24]。有相关研究表明SOCS3可以调节Th17细胞分化而影响IL-22的功能，以达到调控炎症反应的目的[25，26]，即避免过度激活的免疫反应。SOCS3和IL-22的相互作用在MHV-3感染造成的肝脏损伤病理过程中可能起到重要作用，但是其具体的作用机制还有待进一步研究。

综上所述，感染MHV-3后C3H/Hej小鼠体内IL-22和SOCS3表达增加，说明IL-22和SOCS3可能在MHV-3诱导的小鼠慢性肝炎的发生和发展中起重要作用，但是其具体的作用机制还有待进一步研究。通过对细胞因子和细胞因子抑制分子的深入研究，可能为慢性病毒性肝炎的致病机制提供新的理解，同时为治疗提供一个全新的治疗靶点。

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（收稿：2014-02-07）

（校对：陈从新）

Effect of IL-22 and SOCS3 in MHV-3 induced chronic viral hepatitis in mice

Li Yong，Lu Yulei，Wu

Ting，et al.Department and Institute of Infectious Disease，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 400030，Hubei Province，China

ObjectiveTo investigate the changes of interleukin-22（IL-22）and suppressor of cytokine signaling 3（SOCS3）mRNA in murine hepatitis virus 3（MHV-3）induced chronic viral hepatitis in C3H/Hej mice. MethodsChronic viral hepatitis in C3H/Hej mice was induced by intra-peritoneal injection of MHV-3 virus at dose of 100pfu.At day 0，5，10，15 and 20 post-infection，IL-22 and SOCS3 mRNA in the liver tissues were detected by real-time PCR.ResultsIL-22 and SOCS3 mRNA level in livers of model mice at day 0 were（0.26±0.15）% and（6.35±2.21）%，respectively.At day 10，15 and 20，IL-22 mRNA levelsin the liver tissues were（6.28±2.79）%，（2.50±1.24）%and（2.73±0.85）%，respectively，and SOCS3 mRNA levels were（16.92±4.39）%，（14.06±4.09）%and（13.36±1.89）%，respectively，all of which were markedly increased than baseline（P＜0.05）.The mRNA levels of IL-22 and SOCS3 both peaked at day 10 post MHV-3 infection.ConclusionsIL-22 and SOCS3 may play an important role in the pathogenesis of MHV-3-induced chronic viral hepatitis in mice.

Murine hepatitis virus 3；Chronic viral hepatitis；Interleikin-22；Suppressor of cytokine signaling 3；Mouse

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.04.017

国家自然科学基金项目（编号：NSFC81171558, NSFC81271808，NSFC81030007）；教育部创新团队项目（编号：IRT1131）

430030武汉市华中科技大学同济医学院附属同济医院感染性疾病研究所/感染病科（李咏，吴婷，韩梅芳，宁琴）；广西医科大学附属肿瘤医院（陆玉蕾）

李咏，男，32岁，博士研究生。主要从事病毒性肝炎发病机制研究。E-mail:vamos_yong@hotmail.com

宁琴，E-mail:qning@vip.sina.com