基于Nafion-碳纳米管-球形二茂铁甲酸纳米复合物构建的电流型人绒毛膜促性腺激素免疫传感器的研究

蒋 文

( 重庆医药高等专科学校，重庆401331)

0 引言

人绒毛膜促性腺激素 (human chorionic gonadotropin,HCG) 是由胎盘组织的滋养层细胞分泌的一种重要糖蛋白，其生理功能是维持妊娠黄体及影响类固醇的产生，因此，HCG 的测定是早期妊娠(包括早孕、流产和异位妊娠等)和滋养细胞疾病(如葡萄胎、绒癌及滋养层肿瘤、前列腺癌和生殖细胞肿瘤等)诊断的重要指标[1～4]。目前检测HCG 的方法有放射免疫检测法、酶联免疫法、金标试纸卡片检测法、荧光标记免疫检测法、酶标电泳法和电化学免疫分析法等。其中，电化学免疫传感器因其检测速度快、成本低、操作简单、携带方便等优点而越来越受人们的关注。

近年来，纳米材料基于大的比表面积、好的生物相容性以及高的表面反应活性等优点而广泛应用于生物传感器的构建，并极大地提高了传感器的灵敏度和稳定性[5～7]。

该文采用超声溶剂置换方法合成球形二茂铁甲酸纳米粒子，以Nafion 分散的多壁碳纳米管与球形二茂铁甲酸形成纳米复合物，并将其固定在玻碳电极（GCE）表面，用EDC/NHS 将二茂铁甲酸与L-半胱氨酸（L-Cys）交联，形成带有巯基官能团的复合膜，再键合沉积的纳米金 （nano-Au），并通过纳米金吸附人绒毛膜促性腺激素抗体（anti-HCG），最后用牛血清蛋白（BSA）封闭电极上的非特异性吸附位点，从而制得了高灵敏的人绒毛膜促性腺激素免疫传感器。Nafion-MWCNT-FcCOOH 复合膜具有良好的电化学氧化还原活性；电沉积纳米金能阻止电活性探针从电极表面脱落，并为免疫反应提供良好的生物相容性微环境，使免疫分子能保持较高的免疫活性；多壁碳纳米管的引入，提高了电子传递速率，增强了传感器的灵敏度、增大了检测范围和降低了检测限。该实验方法具有电极制作简单，操作简便，灵敏度高，重现性、稳定性和选择性好等特点。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI660E型电化学工作站(上海辰华仪器公司)；AB204-S 电子天平(瑞士Mettler&Toledo 公司)；pHS-3C型酸度计 （上海大众仪器公司）；KQ218 超声波清洗器（江苏昆山超声仪器公司）；透射电子显微镜（H-7500,日本Hitachi Instrument公司）。

人绒毛膜促性腺激素抗原（HCG）和人绒毛膜促性腺激素抗体（anti-HCG）（郑州博赛生物试剂公司）；多壁碳纳米管（MWCNT，中科院成都有机所）；氯金酸、牛血清白蛋白（BSA）、Nafion（Sigma，美国)；0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS)做测试底液。其它试剂均为分析纯试剂，实验用水为二次去离子水。

1.2 球形二茂铁甲酸纳米粒子的制备

取0.1 g 二茂铁甲酸溶于25 mL 的无水乙醇中，在超声条件下以30 mL/min 速度加入125 mL去离子水，继续超声25 min，最后用去离子水洗涤、干燥，储存备用[8]。图1为球形二茂铁甲酸(FcCOOH)纳米粒子的透射电镜图谱。

图1 球形二茂铁甲酸纳米粒子的透射电镜图谱Fig.1 TEM image of spherical ferrocenecarboxylic acid nanoparticles

1.3 Nafion-MWCNT-FcCOOH 纳米复合物的制备

将1 mg MWCNT 和5 mg 球形FcCOOH 纳米粒子加入至5 mL Nafion （0.25%） 的无水乙醇中,超声震荡分散2 h，得到分散均匀的Nafion-MWCNT-FcCOOH 纳米复合物。

1.4 免疫传感器的制备

裸玻碳电极 （GCE，φ=4 mm ） 依次经过1.0 μm、0.3 μm 和0.05 μm 的三氧化二铝糊抛光后，再分别用去离子水、丙酮、乙醇、去离子水超声洗涤、晾干备用。取10 μL Nafion-MWCNT-FcCOOH纳米复合物悬浊液滴涂于GCE 表面并置于室温晾干，然后置于EDC/NHS 活化液中活化2 h，再滴加10 μL L-半胱氨酸并过夜；将洗涤后的修饰电极浸入1%的氯金酸溶液中，在-0.2 V 恒定电位下沉积15 s；将修饰电极置于人绒毛膜促性腺激素HCG 抗体（anti-HCG）溶液中过夜（4℃），再用质量分数为0.25%的牛血清白蛋白(BSA)封闭电极表面非特异性吸附位点，从而制得所需的电化学免疫传感器。图2为免疫传感器的制备过程示意图。

1.5 检测方法

利用循环伏安法（CV）对电极的制备过程进行表征，检测过程中被修饰的GCE为工作电极。以0.1 mol/L 的PBS（pH7.0）溶液作为测试底液，循环伏安法电位区间为0.0～0.5 V，扫描速率为50 mV/s。

图2 免疫传感器的修饰过程示意图Fig.2 The modified process of the immunosensor

利用示差脉冲伏安法（DPV）来记录修饰电极免疫反应前后的电流值，其变化值即为对应抗原HCG 浓度的响应信号，根据响应信号与抗原浓度的线性关系进行HCG 定量测定。

2 结果与讨论

2.1 不同修饰电极的电化学表征

修饰电极在0.1 mol/L PBS（pH7.0）中的循环伏安（CV）扫描图谱如图3所示，裸的GCE 无氧化还原峰峰产生（图3曲线a，插图为其放大图），图3曲线b 是电极表面滴涂Nafion-MWCNTFcCOOH 纳米复合物后的循环伏安图，有一对明显的二茂铁甲酸的氧化还原峰，表明该电活性纳米复合物成功修饰到电极表面。当修饰L-半胱氨酸后，峰电流明显减弱（图3曲线c），这是因为L-半胱氨酸阻碍了电子传递；当沉积纳米金后，由于纳米金有利于电子传输，氧化还原峰电流又明显增强（图3曲线d）；当修饰HCG 抗体和BSA封闭后，由于蛋白分子对电子传输的阻碍作用，氧化还原峰峰值均降低（图3曲线e 和曲线f）。

图3 电极制备过程的循环伏安表征图(a) 裸的GCE；(b)在GCE 表面滴涂Nafion-MWCNT-FcCOOH 复合物；(c) 组装L-半胱氨酸层；(d) 沉积纳米金；(e) 固定一层抗体膜；(f) 用BSA 封闭Fig.3 The diagram of the CVs of the stepwise

将BSA/anti-HCG/nano-Au/L-Cys/Nafion-MWCNT-FcCOOH 复合膜修饰的GCE 与BSA/anti-HCG/nano-Au/L-Cys/Nafion-FcCOOH 复合膜修饰的玻碳电极进行比较发现，有碳纳米管修饰的电极峰电流（图4曲线a）明显高于无碳纳米管修饰的电极峰电流 （图4曲线b），表明MWCNT 的加入有助于增强传感器的响应电流，从而提高其灵敏度。

图4 两种修饰电极的循环伏安比较图谱Fig.4 The comparison cyclic voltammetrys of two modified electrodes.(a)BSA/anti-HCG/nano-Au/L-Cys/Nafion-MWCNT-FcCOOH/GCE,(b)BSA/anti-HCG/nano-Au/LCys/Nafion-FcCOOH/GCE

2.2 免疫传感器在不同扫速下的循环伏安图

图5是该免疫传感器在不同扫速下的循环伏安图。随着扫速从50 mV/s 逐渐增加到500 mV/s，氧化峰和还原峰电流均不断增大，且峰电流与扫速的平方根成正比（图5插图），表明该传感器在缓冲液中的电化学过程受扩散控制。

图5 免疫传感器在不同扫速下的循环伏安图Fig.5 Cyclic voltammetrys of the immunosensor at different scan rates

2.3 实验条件优化

2.3.1 沉积纳米金的时间优化

当电沉积纳米金的时间从5 s到15 s 逐渐增加时，修饰电极的峰电流也逐渐增大，当沉积时间超过15 s时，电极的峰形和可逆性越来越差，因此选择15 s为电沉积纳米金的最优时间。

2.3.2 测试液pH值的选择

在pH值从5.0到9.0 范围内0.1mol/L PBS中该免疫传感器的DPV 电流响应变化情况 （如图6）。当pH值从5.0 增加到7.0时,峰电流逐渐增加；pH 从7.0到9.0 增加时，峰电流下降。实验结果表明，在pH为7.0时，响应电流最大。因此该实验选择pH7.0 的PBS溶液作为测试底液。

2.3.3 孵育时间的优化

将工作电极放入10.0 mIU/mL 的HCG 抗原溶液中孵育不同时间，在0.1 mol/L 的PBS（pH 7.0）中用DPV 测定其响应电流的变化，其结果如图7所示。从图中可以看出，随着时间的进行，免疫反应逐渐完成。当孵育30 min 的时候，峰电流趋于平缓，说明免疫反应达到饱和。因此，该实验孵育时间选择30 min为佳。

图6 测试液pH值对免疫传感器响应的影响Fig.6 The effect of pH on the response of the immunosensor

2.4 免疫传感器的响应特性

在选定实验条件下，传感器在不同浓度的HCG 标准溶液中孵育，图8为免疫传感器DPV峰电流信号对HCG 浓度对数的校准曲线。图中曲线a 和曲线b 分别为免疫电极BSA/anti-HCG/nano-Au/L-Cys/Nafion-MWCNT-FcCOOH/GCE

图7 孵育时间对免疫反应的影响Fig.7 The effect of incubation time on immunoreaction

（电极a） 和免疫电极BSA/anti-HCG/nano-Au/LCys/Nafion-FcCOOH/GCE（电极b）对HCG 浓度对数的校准曲线，插图为免疫电极a 的DPV 响应曲线。免疫电极a 的线性范围为0.05 mIU/mL～200 mIU/mL，最低检测限为0.015 mIU/mL；作为对比，免疫电极b 的线性范围为0.1 mIU/mL～200 mIU/mL，最低检测限为0.04 mIU/mL。

2.5 免疫传感器的选择性

将制备好的免疫电极分别置于不含和含有AFP、CEA、维生素C、L-半胱氨酸、L-赖氨酸和BSA 干扰物质的0.1 mIU/mL HCG 抗原的标准溶液中孵育，并用上述方法检测，其电流响应相差2.4%，表明该免疫传感器具有良好的选择性。

图8 免疫传感器对HCG 的标准曲线Fig.8 Calibration plots of the immunosensor for detection of HCG.(a)BSA/anti-HCG/nano-Au/L-Cys/Nafion-MWCNT-FcCOOH modified GCE,(b)BSA/anti-HCG/nano-Au/L-Cys/Nafion-FcCOOH modified GCE

2.6 免疫传感器的重现性

免疫电极的重现性考查采用5次检测60.0 mIU/mL 的HCG 抗原，5次电流的响应值分别为7.148、7.162、7.179、7.104 和7.212 μA，相对标准偏差为3.9%，表明该传感器具有良好的重现性。

2.7 免疫传感器回收率的测定

分别将标准浓度为0.5、5.0、25.0、50.0、100 mIU/mL 的HCG 加入到HCG 阴性血清中，用该免疫传感器分别对其进行检测，结果列于表1中。加标回收率在96.8%～104.0%之间，表明该免疫传感器对HCG 的检测是准确的，有望运用到临床检测中。

表1 血清加标回收率Tab.1 The recovery of the prepared immunosensor in human serum

3 结论

该文利用Nafion-MWCNT-FcCOOH 复合纳米材料和纳米金，成功构建了高灵敏的电流型免疫传感器。通过循环伏安法和差分脉冲伏安法考察了电极的电化学特性并对电极的性能进行了研究。该免疫传感器具有如以下优点：第一，Nafion-MWCNT-FcCOOH 复合膜具有良好的电化学氧化还原活性和电化学稳定性；第二，电沉积的纳米金可阻止电活性探针从电极表面的脱落，并为免疫反应提供了一个良好的生物相容性的微环境，从而使免疫分子能保持较高的免疫活性；第三，MWCNT 的引入，增强了传感器的灵敏度、增大了检测范围和降低了检测限；第四，该免疫传感器具有制备过程简单、灵敏度高、重现性、稳定性和选择性好等特点。另外，该方法也可用于其它免疫物质的测定，在临床肿瘤标志物的诊断方面有一定的潜在应用价值。

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