果蝇在肿瘤学研究中的优势及应用前景

霍桂桃,吕建军,屈哲,林志,张頔,杨艳伟,李波

中国食品药品检定研究院,国家药物安全评价监测中心,北京 100176

果蝇(Drosophila melanogaster)是研究人类疾病发生机制的理想模式生物,果蝇和哺乳动物的许多基本生物学、生理学和神经系统机能等方面比较相似。果蝇作为研究人类疾病的模式生物,在神经退行性疾病发病机制研究中取得了很大进展,目前已经建立果蝇模型的人类神经系统退行性疾病包括：阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森氏病(Parkinson’s disease,PD)、亨廷顿氏病(Huntingdon’s disease,HD)、朊蛋白疾病(Prion disease)等[1～4]。近年来,人们利用果蝇这一强大的遗传学工具在研究肿瘤的发生、发展以及转移机制方面取得了很大的进展,而且,已经建立并完善了一套快速鉴定与肿瘤形成及发展相关基因的技术。果蝇和哺乳动物在基因和调控通路上的高度保守性、细胞过程的相似性以及肿瘤发生时肿瘤抑制因子出现证据上的保守性等使得果蝇在研究人类癌症发生机制方面具有得天独厚的优势。本文就果蝇在肿瘤学研究中的优势、已经建立的研究人类癌症的果蝇模型进行阐述,并对果蝇在肿瘤学研究中的应用前景进行了展望。

1 果蝇在肿瘤学研究中的优势

1.1 果蝇作为模式生物的优势

孟德尔关于豌豆的遗传学研究是他在寺院进行研究的偶然结果,而与之相反,果蝇作为遗传学研究的重要模式生物则是摩尔根寻找合适的物种进行遗传学研究慎重考虑的结果。果蝇符合摩尔根提出的所有标准,即物种小、生活周期短、容易饲育并且可以获得大量的后代[5]。果蝇的生活周期随其生活的环境温度不同而存在一定的变化,一般情况下,25℃饲养条件的生活周期为10天左右。一对生殖交配果蝇可产生几百个遗传学上一致的后代,而传统的啮齿类动物模型每3～4个月只能获得极少数的后代[6]。

果蝇的发育经历多个不同的阶段,每个阶段可作为不同研究目的的模型。果蝇的发育阶段主要经历胚胎期、幼虫期、蛹期和成蝇期。胚胎通常用于基本发育研究,以检测发育模式形成、细胞命运决定、器官发生、神经元发育以及神经轴突的正确形成。幼虫,特别是能够自由爬动的三龄幼虫,经常被用于研究发育和生理过程,以及觅食行为。果蝇的幼虫期对于药物的研究特别有用,因为幼虫连续进食,很少节制。果蝇幼虫体内包含有其成年后的结构,如成虫盘,成虫盘主要由未分化的上皮细胞组成。从三龄幼虫晚期到蛹期,这些结构经过形态学的变化,最后形成成年果蝇的结构。通过在蛹期对成虫盘发育过程的分子及遗传机制的研究,不仅为果蝇生物学提供了重要的理念,也为人类生物学研究提供了新的思路。因此,蛹是研究某些特定发育过程的理想模型。成蛹期结束后,新羽化的成年果蝇拥有许多进行遗传学研究的评分结构,如刚毛、翅膀、复眼、触角的类型等均可以在不致死的情况下发生突变,这就有利于分离到许多标志性的突变类型,是大多数遗传学研究的重要工具。成年果蝇是一种相对高等的复杂生物,其体内有类似哺乳动物的心脏、肺、肾脏、胃肠和生殖道功能的结构。果蝇的大脑有 100 000多个神经元,形成具体的神经环路和神经纤维网,调控复杂的行为,如昼夜节律、睡眠、学习和记忆、求偶、觅食、打斗、梳理和飞行等[6,7～9]。

果蝇基因组全序列的测序和标注均已完成,果蝇共有4对染色体,编码超过14 000个基因,其中3对染色体含有基因组中的大部分基因。以往的研究证明,果蝇体内的许多基因是人类致癌基因或肿瘤抑制基因的同源物。据统计,大约 75%与人类疾病相关的基因在果蝇体内可以找到同源基因[10],哺乳动物和果蝇的同源基因在核苷酸水平或蛋白序列上的整体同源性达到 40%,而在保守的功能区域,同源性可达到80%～90%[11]。

1.2 果蝇在肿瘤学研究中的优势

1.2.1 果蝇和人类在信号传导通路上的保守性

众多研究表明,果蝇和人类在信号传导通路方面保守性极高,例如,Ras原癌基因的信号通路就是通过研究果蝇眼部感光细胞的发育而被首次阐明[12]。同时在原癌基因研究和果蝇遗传学方面知识的积累为当代人类癌症研究提供了重要的线索。例如,以果蝇 patched/hedgehog 信号通路上Patched突变引起痣样基底细胞癌综合征为线索,确定Patched为肿瘤抑制基因,为人类相应信号通路上的组件可能作为肿瘤抑制基因或致癌基因提供了线索。目前至少发现 patched/hedgehog信号通路上的 3个其他成员与哺乳动物肿瘤形成有关[13,14]。Notch基因最早在果蝇中发现,Notch基因缺失或突变可导致果蝇翅膀边缘缺口,进一步的遗传学和分子生物学研究表明许多Notch的调节器或靶点在进化上非常保守。果蝇 Notch信号的异常表达可导致过度增殖,人类NOTCH1基因的异常表达是引起T细胞急性淋巴细胞白血病的发病因素,同时 Notch信号的激活与许多造血系统肿瘤和固体肿瘤有关[15～17]。人类 JAK/STAT信号通路的紊乱可导致严重的疾病,包括癌症、Polycytemia症、严重的免疫缺陷、过敏以及神经缺失等; 果蝇 JAK/STAT信号通路调节造血干细胞的动态平衡,JAK激酶Hopscotch激活突变诱导可转移的造血系统肿瘤的发生,对照此结果的后续研究发现,人类造血干细胞JAK2激活突变与各种造血系统恶性肿瘤有关[18～20]。Wnt信号通路在进化中高度保守,在生长、发育、代谢和干细胞维持等多种生物学过程中发挥重要作用; Wnt通路的过度激活与多种癌症(包括结肠癌、胃癌、乳腺癌等)的发生密切相关。例如,在结肠癌患者中广泛存在 Wnt通路的调节因子包括APC、beta-Catenin、Axin、TCF等基因的突变,从而造成与生长相关的基因过量表达[21～24]。对果蝇体内人类结肠肿瘤抑制因子APC基因同源物的研究表明,在某些特定的细胞类型中,APC是控制纺锤体定位的必要因素[25]。APC的亚细胞定位与Wnt信号在功能上不存在相关性,而APC氨基末端能够促进 Wnt信号异常表达,这可能与截除氨基末端的APC变异体在人类大肠癌中选择性保留有关[26]。另外,对果蝇发育的研究发现,在通过抑制氨基酸传感和组成性激活 P13K信号的营养限制实验中,中枢神经系统间变性淋巴激酶(Anaplastic lymphoma kinase,ALK)的含量要比其他组织中多,在人类 ALK的研究中发现,人类多种肿瘤中可检测到ALK 的组成性激活[27,28]。Hippo信号通路通过协调细胞增殖和凋亡控制器官的尺寸大小,人类的许多癌症过程中该信号通路出现下调。在果蝇体内的遗传学筛选中发现wart、salvador、hippo和mob为肿瘤抑制基因,这些基因中任何一个功能丧失均可引起显著的增生现象,主要是因为 cycE、DIAP1和bantam转录激活进而引起过度增殖和凋亡下降[29]。由此可见,果蝇和人类在多种信号通路上的保守性为深入研究肿瘤的发生机制提供可靠的信息。

1.2.2 果蝇的遗传学可操作性

1.2.2.1 UAS-GAL4系统 果蝇作为模式生物的主要优势之一就是其基因的可操纵性,简而言之,果蝇体内所有基因的活性,几乎都可在任何细胞类型、细胞发育的任何阶段增强或减弱[30]。目前的果蝇实验技术为检测致癌基因的发展背景提供了独特的优势,例如,基因的异常表达效应就可很容易地利用果蝇来研究,这对研究肿瘤的形成原因非常有用,因为致癌基因通常会被异常活化(如Ras基因)或过度表达(如细胞周期蛋白 D)[31]。果蝇研究者们在不用剖杀动物的情况下,通过特异的启动子异位表达目的基因来研究该基因过度表达后的生物学特性。果蝇系统是独一无二的,因为在果蝇体内可广泛使用多种启动子,包括全身性表达的启动子(如热休克蛋白或Actin启动子)或组织特异性启动子(神经元特异性或眼部特异性启动子等),而且在某个时间范围内,可以通过诱导一种热休克蛋白启动子在时间上控制基因的表达。组织特异性启动子的多样性可允许在不致死的情况下进行基因的特定组织的过表达研究。同样,通过缺失或进行点突变,可将某个基因在体外进行修饰形成具有致癌性的突变基因,并在体内检测致癌基因的活性,利用这种技术检测表明,在2B型多发性内分泌肿瘤中,突变的Ret基因处于超活性状态[32]。酵母UAS-GAL4系统的引入使得果蝇体内基因的异位表达研究变得更加容易,更加多样化。在UAS-GAL4系统中,仅仅需要构建一个驱动目的基因表达的 UAS-cDNA质粒,携带UAS-cDNA质粒的果蝇品系可以和以组织特异性的模式进行表达 GAL4的果蝇品系杂交,通过杂交所获取的后代则在特定的组织表达目的基因。这些先进的技术使得异位活化筛选技术得以发展,其中UAS原件随机插入到果蝇的基因组中,然后便可对感兴趣的过表达表型进行筛选。通过某些基因的过表达导致肿瘤形成来确定这种筛选可被用于确定果蝇致癌基因。同样,UAS-GAL4系统也可在果蝇发育过程中异位表达哺乳动物致癌基因或抑癌基因,以评价这些基因的生物学功能[5,33]。

1.2.2.2 基于FLP/FRT的可抑制的细胞标记物的嵌合克隆(Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker,MARCM)系统 多个基因的变异累积往往会造成复杂的癌症表型,而癌症基因组图谱计划面临的主要挑战之一就是如何理解单个肿瘤中所汇聚的多个基因突变之间的相互作用,以及正常细胞向肿瘤细胞转化所涉及的肿瘤微环境细胞与细胞之间的相互作用。因此,模拟癌症发生发展的模型需能够产生具有复杂表型的特定细胞数量和能在体内追踪这些细胞的行为变化。果蝇作为研究癌症发生机制的模拟系统可产生上述具有复杂表型的特定细胞(即克隆),其在组织内表现为表型正常的细胞,但包含多个突变。这种遗传学上复杂的细胞克隆可通过MARCM系统产生,其原理是将FLP/FRT介导的突变体和非突变体之间的有丝分裂重组与 UAS-GAL4系统结合起来应用于基因的靶向表达或对特定组织内目的基因的RNAi[34]。Pagliarini、Leong、Martin-Belmonte、Igaki等[35～38]研究小组利用MARCM系统阐明了果蝇体内促进肿瘤生长的多基因元件和肿瘤转移之间的合作作用,即通过对果蝇眼部成虫盘scrib-突变克隆的研究发现,肿瘤发生的抑制是由癌组织周围正常细胞激活的JNK调节的凋亡通路来实现的,而肿瘤发生和肿瘤转移潜能的重新获得则是通过同一克隆内 Ras信号上调的协同效应实现的。这些结果强调了scrib-克隆细胞周围正常细胞的作用,这种细胞间的竞争效应类似于哺乳动物癌症中所观察到的; 如果同时激活Ras或Notch信号,JNK调节的细胞凋亡受阻,Ras/Notch则与JNK共同协作,促进肿瘤的生长和侵袭,即 JNK信号激活可促进Scrib缺陷细胞凋亡,当具有致癌活性的 Ras或Notch信号存在时,JNK则驱动细胞过度增殖和肿瘤发生; 同时也有研究证实细胞极性丧失和肿瘤发生在分子水平也存在一定的联系,RasV12异常激活导致JNK活性及E-cad失活,从而使scrib-、dlg-及lgl-克隆细胞向周围正常细胞转移。以果蝇模型研究 JNK调节的肿瘤发生机制时,果蝇细胞所展现的多基因元素与 Ras信号协作促进肿瘤转移的现象同样也发生在哺乳动物乳腺上皮细胞中,这就提示以果蝇进行肿瘤学研究可有助于科学家们进一步阐明哺乳动物体内肿瘤形成及转移机制。

1.2.2.3 双股 RNA 干扰(dsRNAi)的基因筛选 果蝇的遗传可操作性同样也包括在特定的组织敲除目的基因以研究该基因的生物学功能或建立特定的疾病模型,通常使用 RNAi技术干扰特定基因的转录以降低基因的活性,从而达到靶向敲除目的基因的目的,即通过dsRNA反向重复表达引发由Dicer酶调节的复合物诱导同源序列靶向降解,这种基因敲除的方法在果蝇体内非常有效[39]。利用 dsRNAi进行基因功能的研究主要通过将dsRNA注入果蝇胚胎、体内组织特异性表达短的发卡结构的 RNA以及将dsRNA加入培养的细胞的方式来实现。世界转基因果蝇库所储存的果蝇可条件性地表达干涉型双股RNA,几乎可以和果蝇基因组中 90%的基因发生靶向作用[40]。以果蝇为模型的基因组广泛的 RNAi筛选主要集中于与医学相关的几个方面,包括衰老、肥胖、感染、神经系统疾病、癌症等[41]。首次在果蝇体内发现的多个重要的基因,如原癌基因、肿瘤抑制基因、与细胞增殖、分化及死亡相关的重要基因就是通过 RNAi筛选获得的[42]。利用果蝇实施基因组广泛的 RNAi筛选的优势主要表现在以下几个方面：dsRNAi筛选的有效性及良好的基因组注释使得几乎对任何基因及基因片段的研究成为可能; 果蝇和脊椎动物基因组的高度保守性以及重要信号通路的保守性为将果蝇模型的研究结果应用到脊椎动物提供生物学基础; 果蝇强大的遗传学工具和大量的化学、转座子诱导的突变体果蝇及缺陷型果蝇品系为快速体内鉴定 RNAi筛选获得的目标基因奠定了基础; 此外,靶向基因敲除及具有发卡结构的RNA干涉方法的应用使得通过基因工程方法在特定基因中产生丧失功能的基因突变来分析基因的功能成为可能[33,43]。Willecke等[44]利用这一基因技术为筛选体内肿瘤生长所必需的基因建立了一个完善的系统,这种建立在复杂遗传背景基础上的筛选方式可在果蝇体内进行系统的、全基因组广泛性的筛选,加快研究者们对复杂疾病例如癌症的理解。Neumüller等[45]利用 RNAi筛选发现有600多个基因参与调控果蝇成神经细胞的自我更新,其中有些基因为脑肿瘤抑制子,哺乳动物中这些基因的同源物行使肿瘤抑制子的功能,平衡自我更新及干细胞分化。Read等[46]以果蝇RNAi技术研究RTK和P13K信号依赖的肿瘤形成所必需新基因时发现,非典型蛋白激酶RIOK1和RIOK2以Akt依赖的方式在胶质母细胞瘤细胞中过表达,过表达的 RIOK2和 RIOK1、mTor以及 mTor复合物 2形成复合物,过表达的 RIOK2上调 Akt信号,促进小鼠星形胶质细胞肿瘤发生;相反,降低RIOK1或RIOK2的表达则使Akt信号中断,通过 RpL11依赖的核糖体压力检验点诱导 p53激活,从而导致胶质瘤细胞细胞周期结束、细胞凋亡以及化疗敏感性增强。

1.2.3 果蝇相对缺乏基因冗余

脊椎动物基因组在进化过程中的复制常导致产生拥有多个同源旁系的基因子集,在后续的进化中出现基因子集扩展和蛋白功能的多样性。由于这些基因拥有共同的祖先,通常这些基因编码的同源蛋白保持功能上的重叠。当基于单个基因突变进行疾病模型的建立时,基因冗余可以遮盖在模型动物中检测表型的能力,因而使得以模型动物研究疾病发生机制变得更加复杂[33]。与人类等哺乳动物相比,果蝇基因组相对缺少基因冗余,例如Wnt 信号通路中的关键调节因子 TCF 在小鼠中拥有 4 种同源蛋白,而在果蝇中只存在一种同源蛋白[47],因此,利用果蝇作为替代模型研究Wnt信号通路中TCF的功能更容易获得生理上相关的表型。

1.3 利用果蝇进行肿瘤学研究的局限性

果蝇并不是研究肿瘤发生所有方面的理想模型。例如,果蝇具有开放的循环系统,不具有获得性免疫功能。另外,果蝇的生命周期比较短,而人类癌症从根本上讲则主要和衰老有关。尽管人类的每个癌细胞发展所处的基因和微环境是决定肿瘤最终结果的关键因素,但是癌细胞发生、发展的复杂性却很难用实验动物模型来复制。虽然果蝇有一定的局限性,但利用果蝇模型进行癌症方面的研究所取得的成果极大地促进了人们对癌症的理解。

2 已经建立的研究人类癌症的果蝇模型

2.1 人/果蝇嵌合体蛋白BCR-ABL转基因果蝇

费城染色体上(Philadelphia chromosome,Ph)的BCR-ABL是第一个利用果蝇进行研究的人类致癌基因,几乎所有的慢性髓性白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)和某些急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoid leukemia,ALL)都是由该基因引起[48]。人类9号染色体上的癌基因ABL链接到22号染色体上的断点簇集区(BCR),形成p210BCR-ABL融合基因和p185BCR-ABL融合基因,这两种融合基因使相应的BCR、ABL酪氨酸激酶持续激活,引起细胞增殖、黏附和生存性质的改变,从而导致 CML和ALL[49]。为了获得BCR-ABL异构体的活动模式,Fogert等[28]构建了表达P210或P185人/果蝇嵌合体蛋白的转基因果蝇,融合基因包括BCR、人ABLN端序列以及来自果蝇的存在较多差异的ABL的C端尾巴。P185和P210能够挽救dAbl突变果蝇致死表型和ABL信号级联的激活,而且它们的过表达还能产生独特的优势表型,特别是眼睛。同时也能激活正常情况下ABL不能激活的信号通路。这种果蝇模型可进一步帮助研究者发现 BCR-ABL信号级联的组成元件和与P210和P185相关的白血病的独特临床特征之间的差异[50,51]。

2.2 混合系白血病相关的染色体异位(Mixed lineage leukemia(MLL)-associated translocations)

MLL(Mixed-lineage leukemia) 基因,又称HRX、HTRX1、ALL-1或TRX1基因,位于 11号染色体长臂2区3带( 11q23) ,1991年由Ziemin-Van Der Poel等克隆[52]。MLL基因是造血过程调控的一个关键基因,其异常与白血病的发病密切相关。根据 Meyer等[53]所作的统计,MLL基因重排至少有104 种,而已鉴定出的MLL融合基因高达 64 种; 其中MLLAF9(与AML有关)和MLL-AF4(在ALL中发现)是频繁易位的产物。尽管MLL和大多数MLL融合蛋白被整合到携带组蛋白修饰活性的大分子核复合物中,但是目前还不清楚 MLL融合蛋白是如何促进白血病发生的。在果蝇中表达MLL-AF4或MLL-AF9可诱导果蝇在蛹期致死,但这两个融合蛋白对果蝇幼虫大脑的增生和染色体浓缩有不同的作用,且在很大程度上显示可不重叠结合到果蝇唾液腺染色体上[54]。这些现象表明二者具有不同的干扰通路。因此,MLL融合蛋白的C端伙伴基因(Partner gene)可能对嵌合体异常活动具有更重要的作用。

2.3 AML1-ETO融合基因和AML

果蝇是研究与人类致癌蛋白功能相关的增强子、抑制子及修饰基因的有价值的体内筛选平台,在分析AML病人骨髓内的染色体异位时发现,一些转录因子在造血过程中起着非常重要的作用,且在白血病的发生过程中起到关键性的作用。这些因子包括AML1、LMO2、SALL以及SC1/Tali,所有这些因子都可以在果蝇体内找到同源类似物[55]。t(8;21)(q22; q22)染色体异位导致AML1-ETO融合蛋白产生,大概12%的AML病人属于这种情况。AML1是一种具有RUNX结构域的蛋白,在造血过程的多个步骤中起到组织特异性转录激活子的作用; 而ETO(也称作RUNX1T1和MTG8)则行使转录抑制子的功能。一般认为 AML1-ETO融合蛋白是 AML1蛋白功能的组成性抑制子,在抑制髓样分化的同时促进多系祖细胞的增殖[56]。在果蝇中,RUNX因子Lozenge基因控制两个主要的血细胞系中一个细胞系的出现和分化,而且,人类和果蝇的血细胞发育特点比较保守,由此表明果蝇可能是研究 AML1-ETO融合蛋白作用方式的模型[57,58]。AML1-ETO,特别是在 Lozenge血细胞系中,可诱导产生白血病早期表型,其特点是破坏细胞分化和血祖细胞数量增加。此外,AML1–ETO融合基因表达可导致果蝇在蛹期致死的表型。利用体内特异性的RNAi筛选策略,已经确定了Ca2+依赖蛋白酶CalpainB是AML1-ETO诱导果蝇所产生表型的主要因素。更重要的是,人钙激活中性蛋白酶抑制可引起AML1-ETO降解,显著地降低白血病细胞系t(8;21)+的克隆性生长,表明钙激活中性蛋白酶抑制剂可能对白血病的治疗有效。由此可见,果蝇是探寻AML1-ETO相关保守调节因子和研究治疗AML化合物的有效模型[59,60]。

2.4 NF1基因和 1型神经纤维瘤(Neurofibromatosis 1)

1型神经纤维瘤是典型的儿童癌症综合征,是脑部及外周神经系统的一种良性肿瘤。虽然仅有一小部分神经纤维瘤患者会发生恶性转移,但大部分患病儿童出现骨骼缺陷和记忆障碍,大多数患者的NF1基因发生突变[61]。果蝇体内实验证明,NF1调节Ras信号通路。小鼠实验证明,NF1活性降低,与p19ARF和p53共同促进疾病的进程[62]。这为开发治疗神经纤维瘤的Ras通路抑制剂提供了理论基础。

2.5 ErbB-2 基因和乳腺癌

ErbB-2与乳腺癌的发生、发展密切相关,是乳腺癌的一个重要分子标志物。ErbB家族信号通路是一个非常复杂的网络系统,其异常激活可引起细胞生长增殖失控、恶性转化及肿瘤浸润转移。细胞培养实验表明,存在于ErbB-2基因C末端尾巴的5个磷酸化酪氨酸(pTyr)中任何 4个发生自身磷酸化足以引发ErbB-2诱导的转化[63]。以果蝇研究激活的ErbB-2(其C末端5个磷酸化酪氨酸均携带一个点突变)的结果显示,激活的ErbB-2编码的蛋白质所诱导产生的显性表型类似于获得等位基因功能果蝇EGFR的表型[64]。然而,这些表型可被不同的第二位点突变显著抑制,这些突变能够识别特定磷酸化酪氨酸下游的功能特异性配体(Adaptor)及第二信使。有研究表明,ErbB-2在结构上与果蝇EGFR的相关性比与其它哺乳动物EGFRs更强[65]。这就进一步强调了利用果蝇模型研究ErbB-2致癌基因活性的可靠性。

2.6 CDH1基因和遗传性弥散型胃癌(Hereditary diffuse gastric cancer,HDGC)

遗传性弥散型胃癌是常染色体显性遗传的遗传性胃癌综合征,占所有胃癌病例的 1%～3%,主要由胚胎时期编码细胞黏附分子 E-cadherin(E-cad)的CDH1基因突变引起。研究者们在果蝇体内表达突变的E-cad来研究E-cad在HDGC中的作用[66]。在果蝇的翅膀上皮表达两个错义突变(A634V或V832M)的CDH1后,所表达的钙粘蛋白仍保留钙粘蛋白的一些功能,但在不同程度上干扰上皮细胞。事实上,尽管野生型和突变型CDH1定位正确,并与β-catenin 相互作用,但这两种突变体可促进细胞向上皮细胞的基底侧挤压。另外,A634V细胞以细胞连接组的形式移动,V832M细胞则以小的细胞簇或隔离细胞的形式逃离上皮[67]。因此,以果蝇为模型的研究可以揭示由不同的CDH1错义突变所导致的常见的和特定的功能改变。

2.7 肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)和肿瘤微环境

肿瘤细胞的微环境在调节肿瘤发生过程起到很重要的作用,癌症相关的成纤维细胞以及周边细胞与肿瘤细胞的类型有关。这些非转化的细胞通过分泌生长促进信号、抗凋亡信号促进血管生成和组织入侵及转移来调节肿瘤的发展进程。肿瘤细胞的主要特点是具有逃避程序性死亡的能力[68,69]。哺乳动物TNF可调节炎症、免疫及细胞的构成,TNF一方面可促进正常细胞和发生恶性转变细胞的程序性死亡,同时 TNF可促进炎症发生和肿瘤转移。果蝇TNF的同源物 Eiger(Egr)可促进或抑制肿瘤生成依赖于肿瘤的遗传学背景。果蝇眼部和翅膀的 Scrib-/-细胞可通过细胞内小泡Egr-JNK调节的凋亡信号来清除,从scrib突变细胞(scrib-/-;egr-/-)中清除egr引起死亡抑制和促进肿瘤增生,提示egr在scrib突变体组织中具有类似肿瘤抑制子的功能,相反,去除不同遗传背景细胞(scrib-/-;RasV12;egr-/-)中的egr可抑制侵入性肿瘤的发生,提示egr在Ras激活的背景下具有肿瘤增强子的功能; 去除循环血细胞中egr的功能同样可以抑制肿瘤的发展,说明在促进 Ras肿瘤进程时,egr信号通路的作用是非自发的。因此,肿瘤微环境是免疫细胞富集的场所,通过 egr/TNF信号控制细胞的死亡或入侵以及调节肿瘤的发展进程[70～73]。

2.8 EGFR、P13K和脑胶质瘤

人类胶质瘤是来源于神经胶质及其前体细胞的一种致命性的侵袭性肿瘤。胶质瘤发生的同时EGFR和 P13K信号通路处于组成性激活状态[74]。果蝇胚胎神经胶质细胞EGFR和 P13K信号通路的激活导致胶质细胞过度增殖以及幼虫的大脑显著增大。当把胶质瘤移植到果蝇腹部,则这种大脑来源的肿瘤不断长大并入侵邻近组织,而且导致与肿瘤发生相关的一系列基因网落激活,包括Myc、Rb、Cyclins和dTor[75]。有趣的是,EGFR/P13K信号通路在成神经细胞中的激活比较早,不会导致胶质细胞过度增殖,提示果蝇幼虫胶质细胞可能存在一种不同于成神经细胞而有助于胶质细胞转化的状态。

Witter等[76]分析了在果蝇幼虫眼盘胶质细胞中过表达激活的果蝇EGFR、P13K和其他酪氨酸激酶受体(PDGFR/VEGFR、InR、EGFR)的转基因果蝇品系。这些转基因促进胶质细胞增殖,而且,EGFR和P13K可诱导胶质细胞沿视神经异常迁移。因此,这些果蝇模型复制了人脑胶质瘤的主要组织学特征,包括沿神经束入侵大脑结构。过表达EGFR/P13K细胞的侵袭性可以通过饲喂果蝇幼虫 EGFR抑制剂吉非替尼来部分逆转,P13K的抑制剂渥曼青霉素或Akt的抑制剂曲西立滨可完全挽救过表达 EGFR/P13K细胞的表型。Read等[75]研究了激活果蝇幼虫大脑胶质细胞D-EGFR或P13K信号后的表型。通过对这两条通路不同组分的活性进行修饰后发现,EGFR和P13K通路诱导胶质细胞转化起协同作用。移植以后,EGFR/P13K激活的胶质细胞产生较大的侵袭性肿瘤,刺激新的管道生长,其过程类似肿瘤血管生成。

2.9 PAX7-FKHR和横纹肌肉瘤(Alveolar rhabdomyosarcoma,ARMS)

ARMS是一种侵袭性的儿童肌肉癌症,是由两种不同的染色体异位导致PAX3或PAX7的DNA结合域和FKHR/FOXO1的转录激活结构域之间产生嵌合体蛋白引起[77]。PAX-FKHR融合作为致癌基因,干扰骨骼肌肉分化。而正常情况下骨骼肌分化受PAX3和PAX7的调控。有趣的是,在ARMS小鼠模型中,PAX3-FKHR在分化的肌纤维中表达,而在肌肉干细胞中无表达,提示PAX3-FKHR恶性细胞可能在合胞体肌肉组织有丝分裂后产生[78,79]。然而,引起ARMS的细胞类型的起源仍然存在争议。Galindo等[80,81]利用果蝇肌肉来评估PAX-FKHR的活性主要基于果蝇和脊椎动物生成肌肉过程的相似性和果蝇肌肉实时成像的可行性。值得注意的是,在分化的肌肉中表达PAX-FKHR引起合胞肌纤维的单个出芽并散播到其他组织。此外,分别增强或降低Ras的活性可增强或抑制PAX-FKHR相关的表型。因此,PAX-FKHR融合蛋白可能作用于Ras信号通路,通过“逆转”或抑制肌细胞末端分化来促进肿瘤发生。更有意思的是,PAX-FKHR表达可诱导出现基因剂量敏感性的幼虫致死性表型,这可以用于鉴定其功能性伙伴基因的遗传性筛选工作。

2.10 Ret基因和多发性内分泌腺肿瘤综合征 2型(Multiple endocrine neoplasia type 2,MEN2)

多发性内分泌腺瘤综合征是一种罕见的常染色体显性遗传性肿瘤,其发病与原癌基因Ret的突变与激活有关。目前已知MEN2型的突变位点位于Ret原癌基因第10号和11号外显子编码的半胱氨酸丰富的胞外区域。这些突变使胞外的一个保守的半胱氨酸突变为其他氨基酸,从而引起受体的二聚化,并引起其胞内部分酪氨酸残基自身磷酸化,进而激活酪氨酸激酶途径; 此外还有一些其他位点的突变在不引起受体二聚化的情况下,亦能引起受体自身磷酸化,进而激活酪氨酸激酶途径[82]。果蝇和脊椎动物的Rets的表达模式相似,且果蝇体内的RetMEN2突变残基保守[83]。在发育的果蝇眼部表达dRetMEN2A 或dRetMEN2B类似物的突变体可诱导产生一些与人类 MEN2肿瘤相关的表型缺陷,如促进细胞增殖、代偿性细胞死亡和细胞分化异常[84]。这些眼部缺陷的程度与基因剂量有关。大规模的遗传合作筛选准确定位了一定数量的RetMEN2的修饰位点。然而,所有这些修饰位点都可以和dRetMEN2A、dRetMEN2B发生相互作用,由此认为 MEN2A和MEN2B的表型区别可能是由于Ret激酶活性的改变不同,而并非是不同的信号特异性差异。人类同源基因的两个修饰位点TNIK和CHD3/Mi-2a在MEN2相关的嗜铬细胞瘤中出现杂合性丢失,由此推断可能参与肾上腺组织肿瘤生成。此外,给果蝇幼虫饲喂ZD6474(在细胞培养实验中,可以阻止 RET来源的肿瘤蛋白的酪氨酸激酶的活性),可抑制dRetMEN2相关的表型[85]。因此,这种果蝇癌症模型也可能被用来筛选治疗用的化合物。

3 果蝇在肿瘤学研究中的应用前景

以果蝇为模型研究人类癌症相关的致癌基因极其修饰组分的功能,可加速人们对肿瘤发生机制的理解,并为进一步发现用于肿瘤早期诊断的新的生物标志物、潜在的药物作用靶点,为进一步研发抗癌药物奠定基础。虽然目前大多数研究仍集中在肿瘤抑制基因和肿瘤转移机制方面,但现代果蝇研究的新技术和果蝇作为模式生物的独特优势使得果蝇可能成为开发治疗肿瘤药物的理想系统,用于抗癌药物的低-高通量筛选和药物作用靶点的发现。

利用果蝇进行肿瘤学方面的研究不免会遇到很多挑战,如致瘤性炎症、体内筛选作用于癌症干细胞的药物、癌症治疗药物的设计和发现等,这些挑战将使研究者们以全新的角度认识和理解采用“多目标”的方法来治疗癌症。创新技术,如微阵列和纳米技术、计算机和生物信息学与果蝇全基因组分析、染色质功能图谱、果蝇基因组的顺式调控图谱等相结合,可以更准确地确定影响或决定单个癌细胞发展成肿瘤的基因网络或通路。以上这些肿瘤学研究的新的方向,不仅强调了基础研究的价值,也肯定了果蝇作为模式生物在研究癌症复杂性方面的独特优势。

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