蟾酥注射液对仔猪人工感染致病性大肠杆菌的保护作用试验

2014-03-11帅学宏胡庭俊冯世文赖胜基

中国兽医杂志 2014年10期

帅学宏，胡庭俊，曾芸，黄明，冯世文，赖胜基

（1.西南大学荣昌校区动物医学系，重庆荣昌402460；2.广西大学动物科学技术学院，广西南宁530005）

猪大肠杆菌病是由猪致病性大肠杆菌引起的一种急性传染病，给养猪业带来严重的经济损失。蟾酥是中国传统的中药，具有多种药效，尤其在抗肿瘤方面的研究报道较多[1-2]。但关于其抗菌方面的研究报道较少。本试验通过对仔猪预先注射蟾酥注射液，然后采用致病性大肠杆菌进行攻毒，观察受试猪的腹泻情况，并且测定猪外周血T淋巴细胞亚群变化，从而评价蟾酥注射液是否对仔猪致病性大肠杆菌感染具有保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品试剂蟾酥注射液（广西北斗星动物保健品有限公司，批号∶20110101）；穿心莲注射液（广西北斗星动物保健品有限公司，批号∶20091102）；大肠杆菌（中国兽医药品监察所，型号∶C83901）；普通营养琼脂和麦康凯琼脂（北京陆桥生物技术有限责任公司，批号分别为20100305和20100501）。

1.1.2 试验动物 14～21日龄杜长大三元杂交仔猪，公母兼备，体重相近、临床健康。

1.2 方法

1.2.1 蟾酥注射液对仔猪人工感染致病性大肠杆菌的保护试验将60头仔猪随机分为6组，每组10头，分组及处理如下：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（为高、中、低剂量组）：分别按体重0.2mL/kg，0.1mL/kg，0.05mL/kg的剂量肌肉注射蟾酥注射液，1次/d，连用3 d；Ⅳ（药物对照组）：按0.2mL/kg体重肌肉注射穿心莲注射，1次/d，连用3d；Ⅴ（感染不给药组）：按0.2mL/kg体重肌肉注射生理盐水，1次/d，连用3 d，以上5组的仔猪于第4天分别肌肉注射4.0mL大肠杆菌液（3×109CFU/mL）；Ⅵ（空白对照组）：不给药，不攻毒。自攻毒后，观察发病头数，腹泻情况，从发病仔猪粪便中采样分离细菌培养鉴定，连续14 d，试验前后对受试猪称重。

1.2.2 T淋巴细胞标记试验分别在给药前、攻毒前及攻毒后第4天，前腔静脉无菌采血，新鲜血液涂片，冷风立即吹干，冷丙酮-甲醛固定，37℃孵育2 h，孔雀石绿复染10 s，光镜下观察记数，T淋巴细胞内有棕黄色颗粒。T淋巴细胞阳性率=T淋巴细胞数/200个白细胞数。

1.2.3 外周血T淋巴细胞亚群的测定分别在给药前、攻毒前及攻毒后第4天，前腔静脉无菌采血，抗猪淋巴细胞CD4+（7421224，LgG2b）单克隆抗体，为FTTC标记；抗猪淋巴细胞CD8+（7622211，LgG2a）单克隆抗体，为Biotin标记。EPICS2XL流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞亚群。

1.2.4 统计分析用SPSS 16.0软件统计分析。

2 试验结果

2.1 蟾酥注射液对仔猪人工感染致病性大肠杆菌的保护作用攻毒后，从发病猪肠内容物分离细菌后经生化鉴定有该大肠杆菌存在。蟾酥注射液不同剂量组、药物对照组的保护率与感染不给药组比较差异均极显著（P＜0.01）。高、中剂量组与低剂量组比较差异显著（P＜0.05），药物对照组与低剂量组差异不显著（P＞0.05）。增重方面，3种蟾酥注射液剂量组、药物对照组与感染不给药对照组比较差异均极显著（P＜0.01）；药物对照组与空白对照组比较差异显著（P＜0.05）；高、中剂量组与低剂量组比较差异显著（P＜0.05）。见表1。

表1 蟾酥注射液对仔猪人工感染致病性大肠杆菌的保护作用试验

2.2 T淋巴细胞标记测定结果攻毒前，蟾酥注射液不同剂量组及穿心莲注射液药物对照组的T淋巴细胞阳性率与给药前比较均有升高，感染不给药组及空白对照组上升不明显。攻毒后第4天，蟾酥注射液不同剂量组的T淋巴细胞阳性率与接种细菌前比较还有小幅度升高，感染不给药组有较大幅度的降低，穿心莲注射液药物对照组及空白对照组有下降趋势。见表2。

表2 蟾酥注射液对仔猪T淋巴细胞标记试验

2.3 外周血T淋巴细胞亚群的测定结果与感染不给药组相比，高、中剂量蟾酥注射液在首次用药后第4天均能显著升高猪外周血CD4+细胞所占百分比（P＜0.05）。攻毒后第4天，感染不给药组猪外周血CD4+细胞所占百分比与阴性对照组相比显著下降（P＜0.05）；蟾酥注射液高、中、低剂量组猪外周血CD4+细胞所占百分比仍维持在较高水平，与感染不给药组相比较差异极显著（P＜0.01）。药物对照组猪外周血CD4+细胞所占百分比在攻毒后第4天与感染不给药组相比差异显著（P＜0.05）。见表3。

3 讨论

仔猪大肠杆菌性腹泻是由致病性大肠杆菌引起的一类仔猪肠道传染性疾病，是仔猪的一种常见病和多发病。该病已逐渐成为影响养猪业健康快速发展的重要因素之一。此病主要危害2～3周龄仔猪，临床特征是排出灰白色的浆糊样稀便，黏腻腥臭，排便次数不等。病猪消瘦，发育迟缓。本试验将大肠杆菌按3×109CFU/mL×4mL/头的剂量给仔猪攻毒，成功的诱导仔猪产生腹泻。

表3 蟾酥注射液对猪外周血CD4+和CD8+细胞所占百分比的影响（Mean±SD,n=5,单位：%）

蟾酥药理活性强，具有抗肿瘤、强心、升压、兴奋呼吸、增强免疫力等作用[3]。蟾酥能提高小鼠免疫功能，增强小鼠脾脏溶血空斑形成细胞活性，促进巨噬细胞吞噬功能以及增高血清溶菌酶滴度等[4]。蟾酥增强机体免疫功能在医学上已被证实，在动物体上也有研究[5]。有报道蟾酥对活体家兔体内大肠杆菌抑制作用[6]。本试验中，对仔猪预先注射了不同剂量的蟾酥注射液后，再用大肠杆菌攻毒，仔猪的腹泻率显著降低，并且蟾酥注射液剂量越高，保护的效果越好，低剂量组效果较差，可能是由于用药剂量不足。说明蟾酥注射液对此日龄段仔猪由大肠杆菌引起的腹泻有一定的保护功能，可提高仔猪的抗病力。

T淋巴细胞在胸腺内发育后移行至外周淋巴组织，与某种特异性抗原或细胞相互接触时，发挥免疫功能，在机体的细胞免疫和体液免疫诱导中均有重要作用[7]。T淋巴细胞阳性率反映T淋巴细胞数量的变化，很好反映机体细胞免疫机能的高低和评价抗病力的强弱[8]。连用3 d蟾酥注射液后可提高T淋巴细胞阳性率，攻毒后第4天不同剂量蟾酥注射液组的T淋巴细胞阳性率与攻毒前比较有小幅度升高，感染不给药组则有较大幅度的降低。结果表明，蟾酥注射液对仔猪T淋巴细胞的增殖有显著的促进作用。

T淋巴细胞表面抗原CD4+、CD8+分别是辅助性T细胞及杀伤性T细胞的表面特异性标志。CD4+淋巴细胞通过分泌细胞因子来调节机体免疫功能，具有辅助T淋巴细胞转变为效应细胞，辅助B淋巴细胞生成抗体等作用，起到诱导和辅助细胞和体液免疫的作用，称为辅助T细胞[9]。本试验结果表明，蟾酥注射液可显著刺激猪CD4+细胞的增殖，增强猪的非特异性免疫功能，尤其是细胞免疫功能，使机体处于保护性免疫应答状态，从而对猪致病性大肠杆菌感染具有保护作用。