猪关节内细菌的分离鉴定及生物特性分析

何海健，刘晓东，马 涛，姜正前，蒋春燕，张超颖

（1.浙江金华职业技术学院，浙江 金华321007；2.青岛易邦生物科技有限公司，山东 青岛266032；3.浙江同点生物科技有限公司，浙江 杭州310004）

关节肿胀是保育猪的常见疾病，而且常常伴随发生败血性疾病或者脑炎，为猪场造成了严重的经济损失[1]。引起关节肿胀的疾病很多，包括猪链球菌、副猪嗜血杆菌、猪丹毒杆菌、支原体等，但目前常见的病原仍是猪链球菌和副猪嗜血杆菌[2]。从临床症状上很难将这2种疾病区分开来，必须借助实验室诊断予以确诊。本文是在发生关节肿胀的病死猪中，同时从关节和肺脏中进行细菌的分离，比较不同细菌的分离率，并分析这两种细菌在猪体内的生物学特性。

1 材料与方法

1.1 病料来源 从浙江的几个猪场中采集，这几个猪场的保育仔猪均出现关节肿胀，并伴随败血性疾病或者脑炎、呼吸道症状。

1.2 材料 HPS标准菌株：由华南农业大学传染病教研室惠赠；TSA与TSB培养基，购自杭州天和微生物试剂有限公司；Taq酶等PCR反应试剂，购自TaKaRa公司。

1.3 细菌分离 参考尹秀凤等[10]的副猪嗜血杆菌及戴金玲等[11]的链球菌分离方法，用接种环挑取肺脏黏液或者关节液，划线于含5%牛血清及0.1%NAD的TSA平板上，37℃培养16～24 h后，挑取单菌落于含5%牛血清及0.1%NAD的TSB培养基中振荡培养24 h。

1.4 细菌的鉴定

1.4.1 模板的提取 取100μL菌液或者关节稀释液煮沸10min，离心后取上清作为PCR模板，利用PCR方法对细菌进行鉴定。

1.4.2 副猪嗜血杆菌的PCR鉴定 PCR反应引物[2]见表1，PCR反应体系（25μL）：10×Buffer 2.5μL，25mmol／LMgCl20.5μL，2μmol/L dNTPs 0.5μL，20μmol/L上、下游引物各0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，无菌水19μL，模板1μL。反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，30个循环后，72℃延伸10min。

将PCR反应产物进行测序并与NCBI上发布的副猪嗜血杆菌16S基因序列进行比对，进行进一步的确认。

1.4.3 猪链球菌的PCR鉴定 PCR反应引物[3]见表1，PCR反应体系(25μL)：10×Buffer2.5μL，25mmol／LMgCl20.5μL，2μmol/L dNTPs0.5μL，20μmol/L上、下游引物各0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，无菌水19μL，模板1μL。反应条件：94℃预变性3min，94℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s，30个循环后，72℃延伸10min。

将PCR反应产物进行测序并与NCBI上发布的猪链球菌GDH基因序列进行比对，进行进一步的确认。

1.4.4 猪链球菌的分型鉴定 PCR分型引物根据NCBI上发布的猪链球菌cps序列，并参照文献设计[3-5]，引物如表1。

表1 细菌鉴定、分型引物序列

PCR反应体系（25μL）：10×Buffer 2.5μL，25 mmol／LMgCl20.5μL，2μmol/L dNTPs 0.5μL，20 μmol/L GDH及cps1、2、7、9上、下游引物各0.5 μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，无菌水补齐24μL，模板1μL。反应条件：94℃预变性3min，94℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s，30个循环后，72℃延伸10min。

将PCR反应产物进行测序并与NCBI上发布的猪链球菌cps基因序列进行比对，进行进一步的确认。

1.5 小鼠致病性试验 将培养的副猪嗜血杆菌CFU计数后，离心，调整为1010CFU/mL。将25只昆明系小鼠随机分为5组，每组5只，其中1组作为阴性对照，其他4组分别攻毒4株副猪嗜血杆菌，每只小鼠攻毒0.2mL。将死亡的小鼠剖检后，对小鼠重新进行细菌分离，检测死亡小鼠的副猪嗜血杆菌分离率。

2 结果

2.1 细菌的PCR结果 按照上述PCR反应引物及反应体系，可扩增出相应片段大小的PCR产物，将所有的PCR产物测序并比对后，序列同源性均超过97%，证明所分得的细菌为副猪嗜血杆菌或者猪链球菌。

2.2 细菌的分离结果 见表2。

2.3 关节液PCR检测结果 见表3。

表2 细菌的分离结果

表3 关节液的PCR鉴定结果

从表3中可以看出，关节液的PCR结果与细菌的分离结果大体相似，仅在病料8中出现一定的偏差，怀疑可能保存不当或者因吞噬细胞导致菌体崩解。

2.4 小鼠致病性试验 见表4。

所有死亡的小鼠死亡时间均在84 h内，84 h后，所有存活的小鼠耐过。在所有死亡的小鼠体内，均重新分离到了HPS。

表4 副猪嗜血杆菌的小鼠致死率

3 讨论

我们分离的病料中，并不是所有的猪都存在呼吸道症状，但几乎在所有的肺脏中，我们都分离到了细菌。虽然副猪嗜血杆菌是一种条件性致病菌，同时也是呼吸道常在菌，但非致病时，其定居在上呼吸道中，而在肺脏中是不存在的，所以肺脏中分离到的副猪嗜血杆菌，我们怀疑其为致病菌。接着通过小鼠攻毒试验证明其存在致病性。

在欧洲，导致猪发生猪链球菌病以R群的2型猪链球菌为主，其次是1型、9型和7型[6]。从结果中看出，相对副猪嗜血杆菌，链球菌较易从关节中分离到，而关节中副猪嗜血杆菌的分离率很低，这与张玉玉等人得到的结论一致[7]。后来我们用大量的关节液涂布平板，仍然很难见到副猪嗜血杆菌。如果我们假设，引起关节肿胀的疾病与引起呼吸道疾病为同一种病原所致，那么我们有理由怀疑，在副猪嗜血杆菌引起的关节肿胀中，关节内不一定会有菌体的存在，关节肿胀或许由相关毒素引起，或者也有可能由其他致病性因素引起。

从研究中可以看出，在这些病料中，2型和7型发病比例较高。在分离到猪链球菌的6份病料中，肺脏和关节也不是一一对应的关系，无论是分离率还是链球菌的血清型；在一份病料中，我们从肺脏中分离到了2、7型链球菌，但在关节中仅分离到了2型，而在另一份病料中，我们在肺脏和关节中也分离到了不同血清型的链球菌。因此，在一头猪体内，可能存在多个血清型的链球菌，引起呼吸道症状或者败血症状的链球菌，与关节肿胀的链球菌可能不是同一个菌株甚至血清型。不同菌株甚至不同种血清型的链球菌的同时存在，无疑为链球菌的防治提高了难度。

同时，我们从关节分离到的链球菌中，7型的分离比例相对较高。这可能与7型链球菌的靶器官嗜性相关，也可能跟链球菌在不同地区的不同流行性有关[8-9]。

[1] 蔡宝祥.家畜传染病[M].4版.北京：中国农业出版社，2001.

[2]尹秀风，姜平，邓雨修，等.副猪嗜血杆菌的分离与鉴定[J]．畜牧与兽医，2004，36（7）：6-8.

[3]郑升博，华修国，陆伟，等.多重PCR方法检测猪链球菌主要致病血清型及其毒力因子[J].上海交通大学学报（农业科学版），2010，28（1）：53-58.

[4] Okwumabua O，Persaud js，Reddy PG.Cloning and characterization of the gene encoding the glutamate dehydrogenase of Streptococcus suis serotype 2[J].Clin Diagn Lab Immunol，2001，8（2）：251-257．

[5]李小军，张苏华，刘佩红，等.多重聚合酶链反应检测猪链球菌7种主要毒力因子[J].微生物与感染，2007，2（1）：30-33.

[6] Staats JJ，Feder I，Okwumabua O，etal.Streptococcus suis：past and present[J].Veterinary Research Communications，1997，21：381-407.

[7]张玉玉，吴家强，任素芳，等.仔猪多发性关节炎病原菌的分离鉴定及耐药性研究[J].西南农业学报，2012，25（2）：680-685.

[8]赵战勤，胡睿铭，吴斌，等.猪源链球菌的分离鉴定及生物学特性研究[J].畜牧兽医学报，2007，38（4）：3764-381.

[9]王淑杰，徐敏，刘永刚，等.一株血清7型致病性猪链球菌的分离鉴定[J].中国预防兽医学报，2011，33（10）：763-766.

[10]尹秀凤，姜平，邓雨修等.副猪嗜血杆菌的分离与鉴定[J].畜牧与兽医，2004，36（7）：6-8.

[11]戴金玲，许云龙，周玉龙，等.猪链球菌7型的分离鉴定及药敏试验[J].中国畜牧兽医，2013，40（2）：183-186.