北平顶猴伯特绦虫的分子鉴定及驱虫效果试验

王 芸，袁飞舟，徐彩银，黄东体，孔令富，吴志蕾，吕龙宝

（1.中国科学院昆明动物研究所，云南 昆明650223；2.云南农业大学动物科学技术学院，云南 昆明650201）

伯特绦虫主要感染猴和其他灵长类动物，近年来对人类感染也呈流行趋势[1]，极大威胁着人类的生命健康安全。然而在灵长类动物中，通过常规的粪检，虫卵形态易被误认为是粪渣，很难确定伯特绦虫的感染情况。分子鉴定方法由于其特异性强的优点在寄生虫鉴定领域越来越受到重视,近年来进展迅速。本研究所2012年从元江引进了250只北平顶猴繁殖种群，在隔离检疫及过度期饲养过程中，我们发现北平顶猴有疑似感染伯特绦虫的症状，但常规的形态学方法难以确定感染。本研究的目的是建立分子生物学方法鉴定伯特绦虫，并探讨药物治疗伯特绦虫的效果。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 主要分子生物学试剂，均购自上海生工生物工程技术服务有限公司；Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒，购自BioTeke生物公司；DNA纯化回收试剂盒，购自BioTeke生物公司；TECHNE TC-3000G型PCR仪和凝胶图象分析系统，购自韩国UVITEC公司；TG16-WS台式高速离心机，购自上海安亭科学仪器厂；DM1000型显微镜，购自德国LEICA公司；吸绦灭注射液，购自吉林省华牧动物保健品有限公司。内外虫螨净，购自商丘市华康动物药业有限公司。

1.2 虫体样品收集和鉴定 直接从动物粪便中观察到并收集镜检寄生虫的虫体节片，保存于4℃备用。另取节片固定于70%酒精，显微镜下观察其形态结构。

1.2.1 形态学鉴定 将发现的白色节片，固定保存。镜检发现节片周围有大量的不规则卵圆形虫卵，这和用饱和食盐水漂浮法处理动物粪便，显微镜下检查发现的未知虫卵一致，仅仅通过形态鉴别暂时还不能确定其种属，则通过下一步的分子生物学方法进行特异性鉴定。

1.2.2 分子生物学鉴定 将采集的虫体样品约50 mg剪碎,用DNA抽提试剂盒提取DNA，使用引物：BD1：5′-GTCGTAACAAGGTTTCCGTA-3′，DB2（BD）：5′-TATGCTTAAATTCAGCGGGT-3′进行基因扩增。扩增条件为：94℃变性5min（94℃，30 s；51℃，30 s；72℃，1min），30个循环，72℃延伸10min，将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后切胶回收纯化；纯化片段连入pUM-T载体转化E.coli DH5α，摇菌后送往华大基因科技服务有限公司测序。测序结果录入NCBI进行比对鉴定。

1.3 驱虫 对检出并鉴定为伯特绦虫感染的北平顶猴进行驱虫，采用吡喹酮注射液，1次剂量按每公斤体重5mg，分点进行肌肉注射。连用2日；两周后采取新鲜粪便再次进行寄生虫直接涂片检测，对检出仍有虫卵的动物按照以上方法再进行驱虫直至不能检出伯特绦虫虫卵。所有感染伯特绦虫的北平顶猴在治疗后1年再次检测伯特绦虫感染率。

2 结果

2.1 形态学鉴定 在动物粪便中发现的虫卵和节片如图1所示。可见虫卵为不规则的卵圆形，卵盖稍厚（图1A）。白色节片如图所示（图1B），节片长短不一，从3mm～20mm不等，节片放在玻片上滴加生理盐水后，会不停的蠕动，变宽或拉长。

图1 伯特绦虫的形态学鉴定

2.2 分子鉴定

2.2.1 PCR扩增电泳图片 以提取的总DNA为模板设计引物经过PCR扩增其ITS基因片段，通过琼脂糖凝胶电泳检测，由图2可看出扩增出了大小将近500 bp的基因片段。其中左侧的Marker为DL2 000。

图2 绦虫ITS基因电泳结果

2.2.2 ITS基因测序峰值结果 见图3。

图3 ITS基因测序峰值

2.2.3 菌液PCR 见图4。

图4 菌液PCR

2.2.4 ITS基因碱基序列：

CTTCTTCTAAGGTATCGGTCAATTGTGATCAA ATGTTGGTGTGAGTACCGATATCTGTGGTAATAGT AGTTAGTTAAGTAGTAAAGGAGGAGGAGGAGTAG TAGTAGTACGTCAAATCATACATTATTACCTACCT TCGGTGGGGTGCCTAGTCTGCCTAACACCTTGGTG GTGTGCCCGTGTATTTCTTGCTGTTGCTGCTGTTGC ATGAAATGCACCGGTCCATACCCGGGCGGTAGAG TAGTGCACTAGTAGTTGCCACTGCCACTCCTGTTA CCTTCTTTTATTGTGTACATTTTATTGTGCGGTACA TGGGGTAACGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT GTGTGTGAGTGTATATGAGTGTGAGAGAAAAAAT ATGTGTGGGGGGCTCTATTGTGTGCGCTCTATAAA CACCCCCCCCCCCC

图5 与黑猩猩伯特绦虫属DNA序列比对

图6 与日本野生猕猴伯特绦虫属DNA序列比对

2.2.5 ITS基因在NCBI上的序列比对结果 对此基因片段进行测序并将所得序列在NCBI上进行BLAST比对分析，发现该序列与黑猩猩上携带的伯特绦虫属相应区域DNA序列和日本野生猕猴上携带的伯特绦虫属相应区域DNA序列具有较高的相似度，分别为96%和92%，结合观察到的动物表现感染伯特绦虫的症状一致，说明北平顶猴感染的寄生虫与黑猩猩以及日本野生猕猴感染的寄生虫均为司氏伯特绦虫属（图3）。

3 驱虫效果

本研究一共检测了250只北平顶猴，检出82只感染伯特绦虫。对检出并鉴定为伯特绦虫的北平顶猴用吡喹酮进行针对性驱虫，第一次驱虫后检出仍然有45只（54.9%）有伯特绦虫虫卵，对检出仍有伯特绦虫的动物按照以上方法再次进行驱虫后，有9只动物（20.0%）还有虫卵。针对仍然检出虫卵的几只动物按照以上方法再次进行驱虫。第3次驱虫后未检出伯特绦虫虫卵。并于一年后再次对全群北平顶猴进行检测，未再发现有伯特绦虫。

4 讨论

在胃肠道寄生虫感染情况调查时，一般采用粪检虫卵的方法，由于缺乏对具体感染虫种的了解，常常会对虫卵做出错误鉴定，无法准确评估感染情况。我国可见贲昆龙[2]（1978）对灵长类动物携带寄生虫种类进行整理，但这些研究年代已经较为久远，在对实验动物要求不断提高的背景下，其使用的指导性有待于进一步加强。与国内相比，国外对灵长类动物胃肠道寄生虫病的研究较为详尽[3-7]。但各地物种情况与生长环境不同，国外的调查研究难以供现阶段我国灵长类动物驯养管理人员借鉴。

2006年国内首次报道司氏伯特绦虫感染人类[8]，方法只是常规形态学方法，没有涉及分子生物学的判定方法。此外，在2011年有报道患伯特绦虫病的黑猩猩的诊断以及治疗，也是使用常规形态学检测[9]。

国外也有伯特绦虫感染人的报道。2010年报道了一位女孩感染伯特绦虫，其诊断方法是常规形态学鉴定[10]。在同年又有报道显示，在阿拉伯务工回埃及的工人感染伯特绦虫的报道[11]，以及在越南首次发现伯特绦虫感染人的报道[12]，诊断方法同上。鉴于伯特绦虫对人类自身安全的极大危害，而常规的形态鉴别方法可靠性低，迫切需要一种特异性高、更为可靠的鉴别方法。在2011年报道了用分子生物学方法对猴、灵长类和人伯特绦虫病进行了判定和研究，并且比较了它们之间的进化关系[13]，这为建立一个有效的快速准确的诊断方法打下了坚实的理论基础。

在本研究中，通过对250只新引进的北平顶猴进行胃肠道寄生虫检测，首先采用粪检虫卵的方法，检出一种数量最多的卵圆形未知虫卵，通过了两轮检测及内外虫螨净进行驱虫后，仍能检出该虫卵，后在检出该虫卵的动物粪便中发现未知虫体节片并进行分子鉴定，基因序列分析，成功的将其鉴定为司氏伯特绦虫。并对其采用吡喹酮注射液进行针对性驱虫，取得了比较理想的效果。由于在过去的驯养繁殖过程中养殖场在定期驱虫及平时的环境卫生消毒方面做得比较好，未发现过该种虫卵也未见相关的报道。本次研究及虫种鉴定为云南各灵长类动物驯养场肠道寄生虫检测提供了检测依据。

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[7]Myers B J.Kuntz R E.A checklist of parasites and commensals reported for the chimpanzee（Pan）[J].Primates，1972，13（4）：433-471.

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