复方鱼腥草制剂的体外抑菌及耐药抑制作用研究

游思湘，符晨星，瞿俊勇，刘湘新

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙410128；2.湖南农业大学动物科技学院，湖南 长沙410128）

复方鱼腥草制剂是以鱼腥草为主药，辅以黄芩、连翘、金银花和板蓝根等4味中药组成的复方制剂。配方中的鱼腥草具有清热解毒、排痛消肿疗疮、利尿除湿、健胃消食等功效[1]；黄芩有清热燥湿、凉血安胎、解毒功效[2]；连翘具清热解毒、消肿、散结的功效[3]；金银花具有广谱抗菌作用，对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌等致病菌均有较强的抑制作用[4]；板蓝根对多种细菌作用都有很好的抑菌作用[5]。本文采用醇水双提法[6]提取各单方有效成分，并根据君、臣、佐、使的中医药理论进行不同配比组方，探讨不同配比组方复方鱼腥草制剂对耐药金黄色葡萄球菌的体外抑菌和耐药抑制作用，以期为进一步探讨其耐药抑制作用机制并为开发新的对抗耐药菌的药物提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料 主要仪器RE-52A型旋转蒸发器；PYX-250Z-C恒温振荡培养箱；DNP-9162型电热恒温培养箱；YXQ-IS-SII全自动高压灭菌器；SW-CJ-1F净化工作台；电热恒温水浴锅。

菌株：耐药金黄色葡萄球菌（Sa1、Sa2、Sa3、Sa4、Sa5）由中国农业大学提供。中药鱼腥草、黄芩、连翘、金银花和板蓝根等，购自长沙养天和大药房。

培养基：按照NCCLS规定[7]配制各种肉汤培养基和营养琼脂培养基等。药敏纸片杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌液制备 耐药金黄色葡萄球菌用营养琼脂培养基平板37℃培养24 h，挑选典型菌落接种于肉汤中，再经37℃肉汤培养18 h后，将菌液稀释至106CFU/mL备用。

1.2.2 复方鱼腥草制剂的制备 采用醇水双提法。取鱼腥草、黄芩、板蓝根、金银花、连翘等5味中药粉末过20目筛，分别采用醇水双提法提取有效成分，浓缩至含生药浓度为1 g/mL的制剂，灭菌后放置冰箱中备用。将各单方制剂按照一定的比例混合，得到3种不同配比的复方鱼腥草制剂。

1.2.3 体外抑菌试验药敏纸片法[7]取3个配比复方鱼腥草制剂各适量，放入直径为6mm的灭菌滤纸片浸泡2 h，浸泡2次。待其自然凉干后，用紫外线照射灭菌15min。吸取0.1mL菌液于灭菌平皿内，用玻棒铺匀，然后贴上含有药液的纸片，37℃培养24 h，测定抑菌圈直径，取平均值，以此判定药物抑菌效果。

1.2.4 最小抑菌浓度（MIC）的测定 采用二倍稀释法测定[8]，相同过程重复操作3次。

1.2.5 最低杀菌浓度（MBC）的测定 取MIC测定的前4～6管进行涂板，37℃培养24 h，观察有无细菌生长，平皿培养基中计数少于5个菌落者作为该药物的最低杀菌浓度（MBC）。

1.2.6 平板挖孔法[9]将耐药金黄色葡萄球菌在LB液体培养基中培养18 h，经稀释后取0.1mL涂布于普通琼脂培养基上，用打孔器挖出直径约6mm的孔，2孔间距约20mm，然后将0.05mL复方鱼腥草制剂加入琼脂孔内，并在相邻孔内加入一定量用于检测药物敏感性的诺氟沙星，培养18 h，观察并记录结果。

1.2.7 耐药抑制药敏纸片法[10-11]对照组：将在LB液体培养基中培养24 h的金黄色葡萄球菌稀释后吸取0.1mL涂抹于琼脂培养皿上。试验组：将金黄色葡萄球菌在含有抑菌浓度复方鱼腥草制剂的LB液体培养基中培养24 h，稀释后吸取0.1mL涂抹琼脂培养皿上，然后相对应贴上诺氟沙星药敏纸片，于37℃培养24 h，观察并记录结果[7]。

2 结果

2.1 不同配比复方鱼腥草制剂对耐药金黄色葡萄球菌的抑菌圈测定结果 不同配比复方鱼腥草制剂对耐药金黄色葡萄球菌不同菌株的抑菌圈直径测定结果见表1。试验结果表明，3个不同配比复方鱼腥草制剂对耐药金黄色葡萄球菌均有一定的抑菌作用，且对Sa2抑菌作用最佳。

表1 不同配比复方鱼腥草制剂对耐药金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径测定结果 （mm）

2.2 不同配比复方鱼腥草制剂对耐药金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度（MIC）测定结果 复方鱼腥草制剂不同配比制剂对耐药金黄色葡萄球菌不同菌株的最低抑菌浓度（MIC）测定结果见表2、表3和表4。结果表明，复方鱼腥草制剂配比2对耐药金黄色葡萄球菌抑菌效果最佳，Sa2耐药株对各种配比的复方鱼腥草制剂最敏感。

2.3 不同配比复方鱼腥草制剂对耐药金黄色葡萄球菌的最低杀菌浓度（MBC）测定结果 取MIC前4～6管进行涂板，37℃培养24 h，观察结果，3个配比复方鱼腥草制剂对耐药金黄色葡萄球菌不同菌株的杀菌浓度见表5。

表2 复方鱼腥草制剂配比1对5种耐药金黄色葡萄球菌的M IC测定结果 （mg/mL）

表3 复方鱼腥草制剂配比2对5种耐药金黄色葡萄球菌的MIC测定结果 （mg/mL）

表4 复方鱼腥草制剂配比3对5种耐药金黄色葡萄球菌的MIC测定结果 （mg/mL）

2.4 复方鱼腥草提取液耐药抑制试验

2.4.1 平板挖孔法试验结果 平板挖孔法部分试验结果见图1。试验结果表明，Sa1、Sa2、Sa3、Sa4、Sa5抗菌药孔和中药孔中间均未长菌，说明复方鱼腥草提取液的3个配比对耐药性金黄色葡萄球菌Sa1、Sa2、Sa3、Sa4、Sa5均有一定的耐药抑制作用，且对Sa2和Sa5的效果最为明显。

表5 不同配比复方鱼腥草制剂对5种耐药性金黄色葡萄球菌的MBC测定结果（mg/mL）

2.4.2 药敏纸片法试验结果 耐药抑制药敏纸片法抑菌圈直径测定结果见表6。从试验结果可以看出，经过复方鱼腥草提取液处理的耐药性金黄色葡萄球菌Sa1、Sa2、Sa3、Sa4、Sa5对诺氟沙星的敏感程度都有增加，其中对Sa2、Sa5的耐药抑制效果十分明显。

图1 Sa2、Sa5平板挖孔法试验结果

表6 耐药抑制药敏纸片法抑菌圈直径测定结果 （/mm）

3 讨论

3.1 不同配比复方鱼腥草制剂对耐药金黄色葡萄球菌的体外抑菌作用 不同配比复方鱼腥草制剂对耐药金黄色葡萄球菌Sa1、Sa2、Sa3、Sa4和Sa5的效果以配比2最佳。同一配比复方鱼腥草制剂对不同菌株的抑菌效果不同，但3个配比复方鱼腥草制剂均表现出对Sa2抑菌作用最强。可能是不同耐药金黄色葡萄球菌对复方鱼腥草制剂中五味中药的敏感性不同，导致了不同比例组成的制剂抑菌效果有差异。

3.2 不同配比复方鱼腥草制剂对耐药金黄色葡萄球菌的耐药抑制效果 平板挖孔法试验的判断标准是：中药孔与抗菌药孔周围细菌生长，但两孔间出现细菌不生长区域，视为耐药抑制有效；两孔周围及孔间细菌均匀生长成片状，视为中药提取液对细菌耐药性无抑制作用[10-11]。平板挖孔法是中西药物联合使用，从而可直观地得出中西药物的药效协同作用；药敏纸片法通过抑菌环大小可直接体现耐药性变化情况。平板挖孔法和药敏纸片法的试验结果一致表明，复方鱼腥草提取液的3个配比对耐药性金黄色葡萄球菌Sa1、Sa2、Sa3、Sa4、Sa5均有一定的耐药抑制作用，但其中以配比2作用最强，且对Sa2和Sa5的效果最为明显，对Sa3和Sa4的作用不明显。

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