依达拉奉对大鼠延髓缺血后神经元凋亡微血管密度的影响

朱 江，周立立，赵 亮，高燕军，蔡 芫

细胞凋亡是一种以细胞DNA 早期降解为特征，具有特征性形态变化和生化改变的细胞主动死亡过程，不同于细胞坏死过程［1］。在脑缺血性损伤发生发展过程中，损伤后迟发性神经元死亡主要来源于凋亡途径［2］，凋亡神经元的数量直接决定着神经元坏死数量和缺血区域的面积，及时抑制凋亡是挽救凋亡前期神经元的关键［3］。脑部缺血性疾病发生后，脑组织中自由基的过度产生是导致神经元、血管内皮细胞凋亡的主要因素。

依达拉奉(3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮，MCI-186)是一种有效的自由基清除剂。因其分子质量小、脂溶性高，能阻断氧化应激，抑制脂质过氧化［4］，给药后可抑制自由基的产生，从而减轻脑缺血引起的组织损伤，临床上主要用于脑缺血疾病的治疗［5，6］。

本实验将依达拉奉应用于实验模型中，利用其清除自由基、抑制脂质过氧化的药理作用，探讨自由基清除剂对大鼠延髓缺血神经元、微血管的保护作用。

1 材料和方法

1.1 动物与分组 SPF 级Wistar 成年健康雄性大鼠，220～260 g，购于河北医科大学实验动物中心。72 只大鼠随机分为3 组:假手术组、实验组、缺血对照组。按时间点分为7 d、14 d 两个亚组，每组6 只大鼠。

1.2 方法

1.2.1 延髓缺血模型制备 结扎右侧颈总动脉:10%水合氯醛腹腔注射麻醉(350 mg/kg)，仰卧固定，颈部正中切口，钝性分离胸锁乳突肌，暴露分离出右侧颈总动脉并结扎切断，检查无活动性出血后，用生理盐水和青霉素(1×105U/L)冲洗后缝合伤口。电凝椎动脉:大鼠俯卧固定，于后正中线第一颈椎水平处作纵形切口，沿中线分开肌层，暴露第一颈椎横突孔，将高频电刀的电凝刀头插入横突孔内凝闭椎动脉3～4 s，检查无活动性出血后，用生理盐水和青霉素(1×105U/L)冲洗后缝合伤口。待清醒后，单笼保温喂养。

1.2.2 实验动物的干预方法 假手术组只暴露双侧椎动脉及右侧颈总动脉，不做血管阻断处理。实验组、缺血对照组均在阻断双侧椎动脉及右侧颈总动脉后立即开始治疗。实验组每天腹腔注射依达拉奉两次，时间间隔12 h，每次注射计量按3 mg/kg计算，到术后7 d 和14 d 两个时间点分别处死，取延髓。缺血对照组每天腹腔注射生理盐水两次，时间间隔12 h，注射剂量为0.5 ml/次。到术后7 d 和14 d 两个时间点分别处死，取延髓。

1.2.3 实验标本制作 应用10%水合氯醛(350 mg/kg)，腹腔注射。仰卧位固定于鼠板上，快速剪开腹腔和胸腔的前壁，清晰的暴露出心脏，用连有输液管的预先处理为钝圆的针头插入左心室内，快速输入温生理盐水(37 ℃)100 ml，同时用眼科剪剪破右心耳，此时血液由右心耳处流出，待大鼠四肢末端变白，换上4%多聚甲醛(0.1 mol 磷酸盐缓冲液配成pH 7.4)灌流固定。灌流结束后取出延髓，用冰生理盐水冲洗，除去血液。石蜡包埋切片。

1.2.4 Tunel 法操作步骤(1)组织切片至于二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各20 min，用无水乙醇洗2×3 min，95%乙醇、90%乙醇各洗一次，每次3 min，蒸馏水洗两次;(2)将组织切片置于蛋白酶K(20 μg/ml，pH 7.4)溶液中，室温孵育15 min;(3)0.01 mol/L PBS(pH 7.4)冲洗3 次;(4)擦干样品周围的水，滴加50 μl 的Tunel 反应混合液溶液，在温盒中37 ℃孵育60 min;(5)0.01 mol/L PBS(pH 7.4)冲洗3 次;(6)擦干样品周围的水份，加入50 μl 的转化剂-POD，在温盒中37 ℃孵育30 min;(7)0.01 mol/L PBS(pH 7.4)冲洗3 次;(8)加入50 μl 的DAB 底物溶液，室温孵育10 min;(9)0.01 mol/L PBS(pH 7.4)冲洗3次;(10)依次分别用70%、95%、100%乙醇脱水，干燥;(11)二甲苯透明，中性树胶封片。

1.2.5 尼氏染色主要步骤(1)组织贴片自然晾干;(2)无水乙醇+氯仿(1∶1)4 h;(3)100%乙醇(Ⅰ)3 min;(4)100%乙醇(Ⅱ)3 min;(5)95%乙醇3 min;(6)70% 乙醇3 min;(7)50% 乙醇3 min;(8)双蒸水1 min;(9)1%甲苯胺蓝染液，60 ℃恒温箱内染色50 min;(10)双蒸水浸泡数遍;(11)50%乙醇1 min;(12)70%乙醇(含1%冰醋酸)数秒钟，注意观察切片分色情况;(13)95%乙醇(Ⅰ)1 min;(14)95%乙醇(Ⅱ)1 min;(15)100%乙醇(Ⅰ)1 min;(16)100%乙醇(Ⅱ)1 min;(17)二甲苯(Ⅰ)5 min;(18)二甲苯(Ⅱ)5 min;(19)中性树胶封片。

1.2.6 神经元计数及凋亡神经元定量分析每只大鼠取3 张切片(片厚20 μm)，每张切片在400 倍光镜下随机选取5 个视野，输入医学显微图像分析系统(MiVnt)进行图像处理。计数神经元及凋亡神经元，取其平均值为这只大鼠的神经元及凋亡神经元的细胞数。其中，凋亡神经元在光镜下呈现棕黄色［7］。

1.2.7 单宁酸-氯化铁媒染法观察微血管密度的变化 每只大鼠取3 张切片，采用Mivnt 图像分析系统定量分析延髓微血管密度(microvesser density，MVD)。每张切片在100 倍光镜下选5 个视野，计算MVD 值，取平均值作为该只大鼠延髓微血管的MVD 值。

1.2.8 统计学处理 用SPSS13.0 统计软件包处理，数据用均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 有统计学意义。

2 结果

2.1 各组脑组织中神经元数量的变化 通过对7 d、14 d 后实验动物的观察，实验组及缺血对照组中神经元的数量较假手术组明显减少。实验组神经元减少幅度在各时段均低于缺血对照组。同时，实验组神经元凋亡的幅度较缺血对照组的幅度低。与假手术组相比较有统计学差异(见表1、表2)。

2.2 各组脑组织中微血管密度(MVD)的变化通过对7 d、14 d 后实验动物的观察，实验组及缺血对照组的微血管密度(MVD)值较假手术组均减少。但是，实验组MVD 数值减少的幅度低于缺血对照组。与假手术组相比较二者均有统计学差异(见表3)。

表1 各组大鼠脑组织中神经元数量比较(±s)

表1 各组大鼠脑组织中神经元数量比较(±s)

与假手术组比较* P＜0.05，＊＊P＜0.01

表2 各组大鼠脑组织中神经元凋亡数量比较(±s)

表2 各组大鼠脑组织中神经元凋亡数量比较(±s)

与假手术组比较* P＜0.05，＊＊P＜0.01

表3 各组大鼠脑组织中MVD 含量的比较(±s)

表3 各组大鼠脑组织中MVD 含量的比较(±s)

与假手术组比较* P＜0.05，＊＊P＜0.01

3 讨论

细胞凋亡是真核细胞常见的死亡形式，是机体为维持自身稳态而进行的。凋亡细胞在细胞核和细胞质结构上常出现特征性改变，如DNA 断裂、细胞核解体及凋亡小体形成等［8］。细胞凋亡的发生一方面与基因表达内在性因素有关，更重要的则与自由基、兴奋性氨基酸等外在性因素有关［9］，继而引起迟发性神经死亡［10］。

在延髓缺血后，出现神经元数量及微血管密度的减少。在缺血条件下，神经胶质细胞大量增生填充于坏死区域，从而进一步影响到微循环，引起局部微循环障碍。进一步加重神经元的缺血，继而引起迟发性神经元死亡，出现大量神经元胞体凋亡。

通过本实验结果可见，实验组延髓组织的神经元减少的数量、凋亡神经元的数量均低于缺血对照组，提示依达拉奉可通过清除自由基抑制神经元凋亡从而起到保护神经元的作用。实验组中延髓组织内微血管密度较缺血对照组高，说明依达拉奉在延髓缺血过程中通过清除自由基，减轻了微血管内皮细胞损伤，进一步维持神经元单元内部的稳态结构。

本实验结果提示，延髓缺血后由于自由基产生，改变了神经元及微血管所处内环境的稳态结构，出现病灶局部微循环改变，出现迟发性神经元死亡。依达拉奉通过清除自由基，抑制凋亡发生，减轻血管内皮细胞损害，改善了微循环障碍，发挥了对神经细胞的保护作用。

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［3］李小刚，朱 克，李 楠，等.谷氨酸对钙离子内流和凋亡的影响及谷氨酸受体拮抗剂保护作用的研究［J］.中华老年心脑血管杂志，2001，3(2):122－125.

［4］Watanabe T，Tanaka M，Watanabe K，et al.Research and develepment of the free radical scavenger edaravone as a neuroprotectant［J］.Yakugaku Zasshi，2004，124(3):99－111.

［5］Yoshida H，Yanai H，Namkiy S，et al.Neuro protective effects of edaravone a novel free radical scavenger in cerebrovascular injury［J］.CNS Drug Rev，2006，12(1):9－20.

［6］Ding HY，Dong Q.The therapeutic effects of free radical scavenger edaravone on cerebral ischemia［J］.Cerebrovasc Dis Foreign Med Sci，2004，12(7):491－493.

［7］Blondeau N，Laurizen I，Widman C，et al.A potent protective role of lysophospho lipids against global cerebral ischemia and glutamate excite toxicity in neuronal cultures［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2002，22(10):1205－1211.

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［9］陈 津，张如松.细胞凋亡机制概述［J］.中华中医药学刊，2011，29(4):886－889.

［10］尹昌林，熊建琼，文 亮.Caspase-3 在缺血再灌注大鼠脑海马神经元凋亡中作用的实验研究［J］.第三军医大学学报，2004，26(4):1245－1247.