NLRP3 炎性小体在中枢神经系统炎症中的作用

宋丽敏 综述，尚 游，吴 艳 审校

固有免疫是机体重要的防御屏障，含有核苷酸结合结构域和富含亮氨酸重复序列的受体(nucleotide-binding domain leucine-rich repeat-containing receptors，NLR)是一种模式识别受体，在机体受到微生物感染和内源性损伤时，可以识别病原相关分子模式和损伤相关分子模式并被激活，形成炎性小体，激活caspase-1，参与固有免疫应答。

1 炎性小体

炎性小体是细胞内的蛋白质复合体，主要存在于固有免疫细胞中。在外周主要是巨噬细胞、树突状细胞;在中枢神经系统则主要是小胶质细胞。目前已经发现了多种炎性小体复合物，典型组成包括NLR、接头分子含有CARD 的凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)和效应蛋白caspase-1 前体(pro-caspase-1)(见图1)。

NLRs 是胞浆内的免疫受体家族，在人类细胞中已经发现了超过20 种成员。NLRs N 端差异比较大，因此可以据此对NLR 进行分类，已经了解的N 端结构域有4 种:N 端由pyrin domain(PYD)组成的称为NLRP;N 端由caspase 募集结构域(CARD)组成的称为NLRC;N 端由BIR 样结构域组成的称为NAIP 或BIRC;另一种是酸性反式激活结构域。C 端是亮氨酸重复序列(leucine-rich repeats，LRR)，与配体识别有关，在NLR 自身调节方面也有作用。N 端与C 端之间的是核苷酸结合结构域(nucleotide-binding and oligomerization domain，NBT)，与自身寡聚化有关。ASC 由PYD 和CARD 组成，有些NLR 不能直接与pro-caspase 结合，ASC 可以起到衔接作用。刺激因素的作用下，NLRP3 寡聚化，通过PYD 结构域与ASC 结合，ASC 再通过CARD 结构域与pro-caspase-1 同源结合，从而形成多蛋白炎性小体。Pro-caspase-1 在胞浆组成性表达，炎性小体组装形成以后，通过调节两个或多个pro-caspase-1 单体的空间位置关系，启动caspase-1 自身催化活性，使之切割为p20 和p10 两个亚基，即成为成熟的有活性的caspase-1。活化的caspase-1 切割IL-1β 的前体pro-IL-1β，使之成熟并分泌到细胞外发挥生物学效应。NLRP3 与ASC 和pro-caspase-1 组装形成的NLRP3 炎性小体是本文的主要讨论对象。

2 NLRP3 炎性小体

2.1 NLRP3 炎性小体的激活物 有活性的NLRP3 炎性小体的产生需要两个信号:信号一是炎性刺激通过NF-κB依赖性信号通路，引起NLRP3 表达;信号二是NLRP3 激活。NLRP3 可以由外源性微生物及其毒素和内源性危险信号激活，它们的理化特性各不相同。外源性的包括金黄色葡萄球菌及其溶血毒素［1］、李斯特单核杆菌、结核分枝杆菌［2］、肺炎链球菌［3］、腺病毒等。内源性的包括三磷酸腺苷(ATP)、石棉、二氧化硅、尿酸盐、7-溴靛玉红-3、神经酰胺、脂质体、氧化低密度脂蛋白［4］等。

2.2 NLRP3 炎性小体的激活机制 没有内外源性刺激因素作用时，NLRP3 的LRR 结构域通过与泛素连接酶相关蛋白和分子伴侣热休克蛋白90 结合，处于自身抑制状态，但是易于被激活［1］。NLRP3 炎性小体活化的确切机制目前还没有完全明确，目前，被大家较多提及的理论有以下这些(见图2)。

图1 炎性小体的基本组成

图2 NLRP3 炎性小体的激活途径:(1)钾离子外流;(2)ROS产生;(3)吞噬溶酶体内容物释放;(4)钙离子动员

2.2.1 钾离子外流 许多刺激物如微生物的成孔毒素、结晶体，能在细胞膜上形成孔道，引起钾离子外流［5］。细胞死亡、脑缺血等因素都会引起ATP 释放到胞外，ATP 激活胞膜的P2X7 受体，打开该配体门控的离子通道，使钾离子外流。P2X7 受体的激活还可以引起细胞膜上名为泛连接蛋白的大孔道开放，能转运900 道尔顿大小的分子穿过细胞膜，包括钾离子［1，6］。在培养基中加入高浓度氯化钾，抑制钾离子外流，发现结核分枝杆菌等诱导的IL-1β 的产生明显减少［2］。近来，ATP 释放和嘌呤受体信号在NLRP3 炎性小体活化中的作用机制已经得到较为清楚的阐释。

2.2.2 活性氧 活性氧物质(reactive oxygen species，ROS)与氧化应激有关，细胞接受刺激时，氧化酶组装活化，线粒体内ROS 合成［7］，是NLRP3 炎性体活化的重要上游信号。胞浆内硫氧还蛋白结合蛋白(TXNIP)与硫氧还蛋白(TRX)结合，炎性小体的激活物使ROS 产生增加，TXNIP 与TRX 解离，TXNIP 构象改变，与NLRP3 相互作用，引起炎性小体活化［8］。抑制ROS 产生的药物或者线粒体ROS 清除剂都能减少IL-1β 产生［9］。但是，也有研究者认为，ROS 通过NF-κB 途径上调NLRP3 和pro-IL-1β 的表达，而不是直接活化NLRP3 炎性小体。为了特异性地研究ROS 是否在pro-IL-1β 合成以后对NLRP3 炎性小体有影响，在脂质体激活NLRP3 炎性小体模型中，延长脂多糖提前处理的时间，以保证NF-κB 途径的充分活化，再加入抑制ROS 产生的药物，结果同样证实ROS 可以活化NLRP3 炎性小体［4］。

2.2.3 溶酶体内容物释放 溶酶体内有多种蛋白水解酶，包括组织蛋白酶家族，其破坏后这些蛋白水解酶释放入胞浆，可以引起损伤作用，组织蛋白酶B(Cathepsin B)与阿尔兹海默病(Alzheimer disease，AD)有关。Aβ 被小胶质细胞吞噬后，溶酶体肿胀、不稳定、功能失常，Cathepsin B 释放入胞浆，引起NLRP3 炎性小体活化，Cathepsin B 抑制剂使IL-1β释放明显减少［10］。血清淀粉样蛋白A、7-溴靛玉红-3、金黄色葡萄球菌引起NLRP3 炎性小体活化时也是如此。结核分枝杆菌激活NLRP3 炎性小体时，除了Cathepsin B，组织蛋白酶L 也发挥作用［5］。P2X7 受体激活也可引起溶酶体内容物释放。肺炎链球菌引起ATP 释放到胞外，继而溶酶体组织蛋白酶B 释放，NLRP3 炎性小体激活，但是没有巨噬细胞吞噬和溶酶体破坏的参与［3］。

2.2.4 其他 钙离子动员在NLRP3 炎性小体活化中的作用也逐渐被人发现。细胞接受刺激时发生钙离子动员，钾离子外流引起浆膜极化，钙离子内流，吞噬溶酶体破裂也可以引起其内的钙离子进入胞浆。一方面，胞浆内钙超载促进线粒体损伤，产生更多ROS，进一步活化NLRP3;另一方面，单核巨噬细胞浆膜上表达瞬时受体电位通道2，是一种非选择性阳离子通道，ROS 在胞浆的聚集可以引起钙离子通过此通道内流。该通道基因敲除小鼠巨噬细胞中，钙离子内流减少，IL-1β 释放也减少，提示经此途径引起的钙离子内流与NLRP3 炎性小体活化有关［11］。抑制钙离子动员可以抑制NLRP3 炎性小体活化。

以上这些学说都有待阐明，越来越多人接受的观点是，NLRP3 炎性小体的激活是个复杂的、多种机制相互作用、相互影响的过程。

2.3 NLRP3 炎性小体的活性调节

2.3.1 ASC 调节 细胞未接受刺激时，ASC 位于胞核，炎性刺激使ASC 转位到胞浆才能与NLRs 和pro-caspase-1 结合成为聚合体，进而引起IL-1β 处理和分泌。ASC 有3 种新的亚型:ASC-b、ASC-c 和ASC-d，它们的功能各不相同。只有活化状态的ASC 和ASC-b 能与NLRP3 和caspase-1 共定位，激活NLRP3 炎性小体。ASC-c 和ASC-d 作为抑制亚基，前者只与caspase-1 共定位，后者既不与NLRP3 也不与caspase-1共定位，都不发挥活化作用［12］。

2.3.2 特殊蛋白调节 COPs(CARD-only proteins)是只含有CARD 结构域的蛋白家族，目前发现的成员包括Iceberg、COP1/Pseudo-ICE、INCA、caspase-12s、和Nod2-S。它们与pro-caspase-1 的CARD 结构域结合，使后者不能与ASC 结合，不能形成炎性小体。POPs(PYD-only proteins)是只含有PYD 结构域的蛋白家族，较多提及的是POP1 和POP2，与ASC 或者NLRP 的PYD 结构域结合，阻止炎性小体形成;还可以阻止NF-κB 的激活，从转录水平抑制NLRP3 表达。一些病毒株可以通过自身的病毒POPs 抑制炎性小体活化［14］。

2.3.3 其他调节 细胞间相互作用也可以调控炎性小体的激活。小鼠CD4+效应T 细胞和记忆B 细胞能够抑制caspase-1 活化和IL-1β 成熟，主要是针对NLRP3 和NLRP1，通过T 细胞表达的肿瘤坏死因子家族配体实现［13］。细胞自噬对NLRP3 炎性小体活化也有调节作用。自噬过程调控长寿命蛋白质、蛋白多聚物和入侵微生物的降解，缺乏自噬功能的细胞，NLRP3 炎性小体更易被激活［9，14］。

3 NLRP3 炎性小体与中枢神经系统炎症

小胶质细胞是在中枢神经系统定居的免疫细胞，其活化可以引起炎症反应。正常情况下，IL-1β 在脑中有低水平表达，NLRP3 炎性小体激活使IL-1β 大量成熟并分泌到细胞外，引起炎症反应，激活一些病理生理过程。多种中枢神经系统炎性反应与NLRP3 炎性小体的活化有关。

3.1 NLRP3 炎性小体与神经退行性疾病 细胞外Aβ聚集形成的斑块在AD 的发生发展中有重要作用，小胶质细胞募集在Aβ 斑块周围，发挥吞噬作用并被活化，IL-1β 是针对Aβ 的炎症反应的主要细胞因子，AD 患者脑脊液中IL-1β含量明显升高。Aβ 被小胶质细胞吞噬后激活NLRP3 炎性小体，M2 型标记物Arg-1、IL-4 表达减少，M1 型标记物NOS2等表达增多，说明小胶质细胞从M2 型转变为M1 型［15］。产生的IL-1β 和其他的促炎性细胞因子、神经毒性因子，对周围的神经元等造成损伤，进一步放大Aβ 的致病作用［10］。同时，活化的小胶质细胞清除Aβ 的能力下降，引起Aβ 斑块沉积增加。

多发性硬化症(MS)是中枢神经系统的自身免疫性炎性脱髓鞘疾病，MS 斑块和MS 患者血液中caspase-1 含量都有明显增高，脑脊液中IL-1β 明显增多，Nlrp3 基因变异的患者体内检测到MS 样损伤。实验性自身免疫性脑脊髓炎是MS的动物模型，该模型脱髓鞘病灶内有小胶质细胞的活化和聚集，而且早于临床症状出现，NLRP3 炎性小体活化可以加重病情进展［16］。

3.2 NLRP3 炎性小体与感染性疾病 脑脓肿的主要病因是金黄色葡萄球菌感染中枢神经系统，感染后数小时内就有小胶质细胞的激活，以及多种促炎性因子的快速产生，引起广泛的炎症和坏死。IL-1β 是金葡菌激活小胶质细胞产生的主要细胞因子，部分是通过激活NLRP3 炎性小体产生的，还有一部分是通过非炎性小体途径产生的。NLRP3 炎性小体的激活有赖于活细菌产生的ATP 和α-、γ-溶血毒素，cathepsin B 在此过程中也发挥作用［1］。

脑膜炎是肺炎链球菌感染性疾病中预后最差的，死亡率达到15%～30%，caspase-1 是该病炎症反应的主要调节物质。NLRP3 和ASC 表达缺失可以减低小鼠肺炎球菌性脑膜炎的临床评分、组织损伤程度和脑的炎症，用IL-1β 抑制剂可以观察到ASC 和NLRP3 依赖性的病理学缓解［3］。

小胶质细胞是结核杆菌在中枢神经系统感染的主要靶细胞，活化的小胶质细胞与其他细胞共同作用，释放多种促炎因子和趋化因子，结核性脑膜炎患者脑脊液中IL-1β 有明显增高。用结核分枝杆菌感染巨噬细胞，获得条件培养基，再用此处理小胶质细胞，最后经结核杆菌感染，可以发现明显的caspase-1 活化和IL-1β 释放，并且发现IL-1β 的成熟是NLRP3、ASC 和ROS 依赖性的。地塞米松治疗结核性脑膜炎的作用，部分是通过抑制ROS，从而抑制NLRP3 炎性小体激活来实现的［2］。

4 总结

NLRP3 炎性小体是近年来的研究热点，目前已经发现了多种内源性和外源性物质可以发挥激活作用，有关其活化和调节的分子机制也在逐渐阐明，NLRP3 炎性小体的激活引起IL-1β 成熟，在中枢神经系统固有免疫中发挥重要作用。特异性抑制NLRP3 炎性小体的活化途径，是相关疾病新的治疗靶点。

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