EPO 对Alzheimer 样大鼠记忆能力及海马synapsin1 蛋白表达的影响

李宜培，刘 芳，尚俊杰，靳 力，王 黎

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是老年痴呆最常见的类型［1］，其主要病理学特征为神经细胞外以β-淀粉样蛋白(β-amyloid peptide，Aβ)沉积为主的老年斑(senile plaque，SP)、以神经细胞内异常磷酸化的tau 蛋白聚集为核心构成的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)以及皮质、海马选择性的神经元变性和缺失［2］。Aβ 作为老年斑的主要组成成分，被认为是导致神经元损伤和认知功能障碍的主要原因［3］。近年来的实验表明，促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)作为一种保护性细胞因子，在各种脑损害中发挥着重要的神经保护作用［4］。为探讨EPO 在AD 治疗中的潜力，本实验采用大鼠海马注射凝聚态Aβ1-40的方法复制AD 动物模型［5］，通过腹腔注射重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin，rHu-EPO)，观察了EPO 对AD 大鼠记忆能力和海马超微结构的影响，检测海马突触蛋白1(synapsin 1，SYP1)蛋白的表达，并初步探讨了其可能机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 雄性2 月龄Wistar 大鼠55只，清洁级，体质量250～300 g，动物批号:SCXK(豫)2005-2001，由河南省实验动物中心提供。Y 迷宫法筛选后48 只大鼠随机分为4 组:正常对照组、生理盐水组(normal sodium，NS)、模型组、EPO 治疗组，每组12 只。动物自由饮食，昼夜交替饲养，饲养室温度保持为15 ℃～20 ℃。

1.2 主要试剂和实验仪器 Aβ1-40(美国Sigma 公司);rHu-EPO(上海克隆生物高技术有限公司);多聚甲醛(美国BBI 试剂公司);兔抗synapsin1多克隆抗体，兔抗β-actin 多克隆抗体，辣根过氧化物酶标记的二抗(美国Santa Cruz 公司);动物组织总蛋白抽提试剂，ECL 化学发光试剂盒(美国Pierce公司);显影定影试剂盒(武汉博士德公司)。Y-迷宫(MG-3 型)(张家港生物医学仪器厂)，脑立体定位仪(ZH-蓝星B)(安徽省淮北正华生物仪器设备有限公司)，透射电子显微镜(荷兰FEI TecnaiG)。

2 实验方法及步骤

2.1 Aβ1-40孵育 1 mg Aβ1-40溶于500 μl PBS 中，稀释为浓度2 μg/μl，置于37 ℃恒温箱中连续孵育12 d，蛋白充分伸展形成聚合态后4 ℃保存。

2.2 术前训练 48 只大鼠每天上午固定时间Y 迷宫训练，每天20 次，连续5 d，每只大鼠都达到学会标准，即连续9 次在60 s 内一次到达安全区。电刺激参数:电压50～70 V，延时5 s［6］。

2.3 大鼠模型的建立 6%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(300～360 mg/kg)后固定于脑立体定位仪上，参照《大鼠脑立体定位图谱》［7］进行定位。使用微量进样器施行海马注射，每侧海马注射5 μl。NS 组按照造模方法海马注射NS 5 μl，正常对照组大鼠不做处理。EPO 治疗组大鼠在正常喂养的基础上从造模手术当天开始腹腔注射5000 IU/kg rHu-EPO，隔天一次，共5 次。

2.4 Y 迷宫行为学测试 手术后第10 天各组大鼠进行行为学测试。按照术前训练中的学会标准，记录各组中每只大鼠错误次数、尝试次数和全天总反应时间。

2.5 海马电镜标本的制作及观察 造模手术后第10 天，Y 迷宫测试完毕后，每组随机抽取2 只用于透射电子显微镜取材。大鼠麻醉、灌注后切取海马CA1区组织块约1 mm3。包埋后，荷兰FEI TECNAIG 透射式电镜下观察并照像。

2.6 Western blot 蛋白印迹实验 造模手术后第10 天，Y 迷宫测试后，每组中随机选取6 只大鼠，麻醉后断头，取出脑组织，冰上剥离海马，称重。应用Western blot 检测SYP1 蛋白的表达。

3 结果

3.1 空间记忆能力的改变 与NS 组相比，模型组大鼠错误次数、尝试次数和全天总反应时间增加而EPO 组大鼠空间记忆能力提高，差异有统计学意义(P＜0.05)。EPO 治疗组大鼠错误次数、尝试次数和全天总反应时间均减少，与模型组比较差异有统计学意义(见表1)。

3.2 EPO 对大鼠海马超微结构的影响 正常对照组和NS 组:电镜下可见海马神经突触前后膜均一，厚度适中;突触前膜内的突触小泡清晰可见，突触间隙清晰;线粒体大小及形态正常，线粒体膜、嵴完整，内嵴清晰可见，基质均匀，粗面内质网散在分布，表面游离核蛋白体较多。模型组大鼠电镜下神经细胞形态破坏，结构紊乱。突触密度降低，且均匀不一，突触间隙变小不清，突触小泡数量减少;游离核蛋白体减少，线粒体膜不完整，线粒体嵴模糊。EPO 治疗组大鼠神经元结构基本正常，突触前膜内突触小泡较清晰，突触间隙清晰;线粒体膜基本完整，线粒体嵴清晰可见。

3.3 Western blot 蛋白印迹实验 各组海马组织中均可见SYPl 蛋白表达。与模型组相比，EPO 组SYPl 蛋白表达明显增加，差异有统计学意义(P ﹤0.05)。

表1 各组大鼠学习记忆能力比较(n=12)

4 讨论

促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)是刺激红细胞合成的细胞因子，是组织氧合状态的一种主要决定因素，目前临床上多用于贫血的治疗。许多研究表明EPO 作为一种近年来发现的新型神经元保护因子可以提高肾性贫血患者的认知能力［8］，可以明显抑制缺血缺氧性脑损伤中神经元的凋亡［9］，也可以通过抑制Aβ25-35引起cleaved caspase-3 表达增高而对其诱导的细胞凋亡发挥保护作用［10，11］。本实验采用大鼠海马注射凝聚态Aβ1-40的方法，成功建立公认的急性Alzheimer 样大鼠模型，观察了EPO 对AD 大鼠记忆能力和海马超微结构的影响，检测SYP1 蛋白的表达。

线粒体是存在于真核生物细胞质中、含有核外遗传物质的细胞器，是细胞能力的化工厂。已有研究表明，AD 的发生与线粒体的结构和功能障碍密切相关［12～15］。突触是神经元之间一种特化的细胞连接，是神经元信号传递的重要结构，通过它的传递作用实现细胞之间的通讯。大量实验表明，学习记忆与中枢神经系统突触的结构和功能的可塑性密切相关。突触结构的破坏会中断脑内很多功能通路中的联系，引起多方面的功能障碍，尤其严重的是认知和记忆障碍。本实验中EPO 提高AD 大鼠空间记忆能力，减轻大鼠海马线粒体和突触的破坏，减轻AD大鼠的海马超微结构损伤程度，减轻其功能的丧失，进而改善AD 大鼠的认知功能障碍。

SYPl 是一种神经元特异的磷蛋白，该蛋白的表达在海马结构形成及功能可塑中发挥一定作用，在突触发生、突触囊泡运输及神经递质释放过程中也有重要的调节作用［16，17］。本实验发现，模型组大鼠海马组织中由于Aβ1-40对神经元的毒性作用，间接抑制了SYP1 蛋白的表达，而EPO 治疗组大鼠与模型组相比SYP1 蛋白表达明显增加，说明EPO 能够拮抗Aβ1-40对神经元毒性作用，增加SYPl 蛋白的表达，导致递质释放增加和突触传递能力提高，这可能是EPO 改善AD 大鼠空间记忆能力的另一个机制。另外，与NS 组相比，EPO 治疗组大鼠SYPl 蛋白表达增加，这提示EPO 对正常大鼠可能也有促进SYPl 蛋白表达的作用。

综上所述，EPO 可以改善大鼠由Aβ1-40引起的学习记忆障碍，提高空间记忆能力，这可能与减轻大鼠海马组织超微结构破坏、减轻其功能的丧失、增加SYPl 蛋白表达发生有关，其深层机制仍有待进一步探索。

［1］Lim GP，Yang F，Chu T，et al.Ibuprofen suppresses plaque pathology and inflammation in a mouse model for Alzheimer’s disease［J］.Neurosei，2000，20(15):5709-5714.

［2］王德生，张守信.老年性痴呆［M］.人民卫生出版社，2001.60-77.

［3］Lim YY，Ellis KA，Harrington K，et al.Cognitive consequences of high Aβ amyloid in mild cognitive impairment and healthy older adults:implications for early detection of Alzheimer’s disease［J］.Neuropsychology，2013，27(3):322-332.

［4］邵长荣，姜 红.促红细胞生成素对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠水通道蛋白4 表达的影响［J］.实用儿科临床杂志，2012，27(14):1075-1077.

［5］Arif M，Kato T.Increased expression of PAD2 after repeated intracerebroventricular infusions of soluble Abeta(25-35)in the Alzheimer’s disease model rat brain:effect of memantine［J］.Cell Mol Biol Lett，2009，14(4):703-714.

［6］Huang JN，Wang CY，Wang XL，et al.Tenuigentin treatment improves behavioral Y-maze learning by enhancing synaptic plasticity in mice［J］.Behav Brain Res，2013，246(1):111-115.

［7］Paxionos G，Watson C.诸葛启钏译.大鼠脑立体定位图谱［M］.北京:人民卫生出版社，2005.25.

［8］Juul S.Erythropoietin in the central nervous system，and its use to prevent hypoxic-ischemic brain damage［J］.Acta Paediatr Suppl，2002，91(438):36-42.

［9］Juul S.Erythropoietin in the central nervous system，and its use to prevent hypoxic-ischemic brain damage［J］.Acta Paediatr Suppl，2002，91(438):36-42.

［10］Ma R，Xiong N，Huang C，et al.Erythropoietin protects PC12 cells from beta-amyloid(25-35)induced apoptosis viaPI3K/Akt signaling pathway［J］.Neuropharmacology，2009，56(6):1027-1034.

［11］孙治坤，杨红旗，陆国强，等.促红细胞生成素对β-淀粉样蛋白诱导细胞凋亡的保护作用［J］.上海交通大学学报医学版，2007，27(10):1177-1180.

［12］Schaffer S，Asseburg H，Kuntz S，et al.Effects of polyphenols on brain ageing and Alzheimer’s disease:focus on mitochondria［J］.Mol Neurobiol，2012，46(1):161-178.

［13］Cavauucci V，Ferraina C，D’Amelio M.Key role of mitochondria in Alzheimer’s disease synaptic dysfunction［J］.Curr Pharm Des，2013，19(36):6440-6450.

［14］Manczak M，Sheiko T，Craigen WJ，et al.Reduced VDAC1 protects against Alzheimer’s disease，mitochondria，and synaptic deficiencies［J］.Alzheimers Disease，2013，37(4):670-690.

［16］刘 芬，闫 荣.Aβ1-40对PC12 细胞突触素表达的影响［J］.中风与神经疾病杂志，2010，27(9):49-52.

［17］桂 韦，余传勇，汪 凯，等.转化生长因子β-1 对神经元树突生长以及突触素1 表达的影响［J］.中风与神经疾病杂志，2011，28(10):25-28.