脑梗死患者P2Y12 与CYP2C19 基因突变的临床学特征及其与氯吡格雷动态抵抗的相关性

石红婷，周伯荣，王 融，邓燕华，关海涛，刘子凡

氯吡格雷［1］作为一种常见的抗血小板聚集药，临床试验已经证明长期使用氯吡格雷能有效地减少严重不良心脑血管事件(major adverse cardiovascular and cerebrovascular events，MACCE)，然而，因为个体差异，有部分患者虽然长期规律服用氯吡格雷，但仍会出现心脑血管事件，这种现象称为氯吡格雷抵抗(clopidogrel resistance，CR)［2］。CR 发生率约16.8%～21%不等，在TIA 及卒中人群中可达到44%。我们近期研究结果［3］显示，脑梗死患者CR 发生率为30.6%，与国内外文献报道的CR 发生率(脑梗死人群)为28%～44%接近［3］。

脑梗死患者CR 发生率较高［4，5］。过去大部分的研究都集中在患者的CR 率。2013 年，我们的研究组首次报道的CR 动态特性的存在［4］。在本文中，我们分析了P2Y12 和CYP2C19 等位基因的临床学特征，并观察在脑梗死患者中P2Y12 与CYP2C19 基因突变与DCR 发生的相关性。我们希望指导临床早期发现或预测个体将出现血小板抵抗现象。

1 材料和方法

1.1 研究设计 采用前瞻性、开放性、单盲研究，对入组的脑梗死患者按标准给予氯吡格雷(75 mg/d)，且继续服用常规药物，如降压、降脂、降糖等，分别测定服药前、服药2 w、3 个月及6 个月后的PAR。根据服药2 w 后的PAR，分为CR 组与NCR组，出现CR 的患者将换用或联用其他抗血小板药物(如阿司匹林、西洛他唑等)，并检测其2 w 后的PAR 的变化，NCR 患者维持氯吡格雷(75 mg/d)治疗，测定3 个月、6 个月后PAR，分为动态抵抗(DCR)组与持续非抵抗(CNCR)组。同时本研究按是否携带P2Y12εC，分为TT 组和C 组;按是否携带CYP2C19εA，分为GG 组和A 组;按共存基因，分为共存C 与A 组、共存T 与A 组、共存C 与G 组及共存T 与G 组。根据AHA/ASA(2011 年)发表的脑卒中二级预防指南，所有患者采用电话等方式嘱患者继续服药。并要求患者按时到门诊就诊，测定相关实验指标。

1.2 研究对象 连续性选取2011 年9 月～2012 年12 月在广州医科大学附属第三医院神经内科住院的首次或再次新发的急性脑梗死患者147例，脑梗死组纳入标准:诊断符合世界卫生组织制定的标准［6］，经头部计算机断层扫描(computed tomography，CT)或3.0T 磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)证实。详细的分组标准和排除标准见已发表的文献［4］。本研究经过广州医科大学附属第三医院伦理委员会批准，所有患者或其家人均签署知情同意书。

1.3 血小板聚集率测定 按仪器相关要求［4］，使用的透光率集合度测定(light transmission aggregometry，LTA，CHRO-N02L0G Corporation，USA)血小板聚集功能。相关研究证实这种方法评估血小板聚集功能是临床和研究中最常用的方法之一，并作为金标准［7］。CR 的判断标准［8］，使用ADP 作为激动剂的血小板聚集抑制率，即氯吡格雷给药后14 d血小板聚集比基线下降幅度≤10%称为氯吡格雷抵抗(血小板聚集抑制率=治疗前血小板聚集率-治疗后血小板聚集率)，反之为氯吡格雷敏感。

1.4 危险因素评估 入院后记录患者的性别、年龄、血压，仔细询问患者既往史、个人史、服药史、家族史等。所有患者入院后当日行头部CT 或MRI检查，次日行血常规、凝血常规、生化常规、血脂常规、糖化血红蛋白及血糖等检查。

1.5 基因分析 分析患者P2Y12 与CYP2C19基因。采取德国QIAGEN 公司制备的基因组DNA试剂盒从全血中提取DNA。引物由宝生物(大连)有限公司合成。详细分析基因的过程及基因图片见已发表的文献［4］。

1.6 统计学方法 采用SPSS16.0 软件进行分析。计量资料用均数±标准差(±s)表示，数据不符合正态分布，用配对比较资料的秩和检验(Mannwhitney test)，计数资料用t 检验，对影响基因的临床特征学多因素采用Logistic 回归分析。基因型和等位基因频率采用基因直接计数法计算，应用拟合优度检验计算基因型分布是否符合Hardy-Weinberg 平衡(H-W 平衡);各组间基因型及等位基因频率比较四格表χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者一般资料的比较 符合上述标准脑梗死患者共147 例，其中26 例(17.7%)因经济负担、外地定居及支架植入术需使用双抗治疗等退出本研究，包括6 例CR 患者及20 例NCR 患者，因此本实验动态观察121 例脑梗死患者。观察结束，各组被完成的病例数分别为CR 组(36 例)、NCR 组(85 例)、DCR 组(15 例)、CNCR 组(70 例)。按等位基因分组分析，P2Y12 基因中TT 组与C 组比较及CYP2C19 基因中GG 组和A 组比较在性别、年龄、吸烟等入院时一般临床特征上差异无显著性(P＞0.05)(见表1)。

2.2 P2Y12 和CYP2Y19 等位基因的临床学特征分 析 LDL-C(OR=3.581，95% CI 2.070～6.195，P=0.000)为P2Y12εC 的临床学因素(见表2);而甘油三脂(OR=2.812，95% CI 1.498～5.281，P=0.001)及糖化血红蛋白(OR=2.327，95%CI 1.231～4.398，P=0.009)为CYP2Y19εA 的临床学因素(见表3)。

2.3 P2Y12 和CYP2Y19 等位基因或共存基因各组不同时间段血小板集率的比较 在P2Y12 组，C 组患者服用氯吡格雷前、服用2 w 后、3 个月后及6 个月后的PAR 与TT 组比较，差异无统计学意义(P＞0.05);而CYP2Y19 组，A 组患者在这4 个时间段与GG 组比较，A 组患者PAR 都较高，差异有统计学意义(P＜0.05，见表4)。共存C 与A 组患者服用氯吡格雷前、服用2 w 后的PAR 高于共存T 与A、共存C 与G 及共存T 与G 者，差异有统计学意义(P＜0.05)，而3 个月后及6 个月后差异无统计学意义(P＞0.05，见表4)。

2.4 CR、NCR、DCR、CNCR 各组患者基因型和等位基因频率的分布和分析 CR 及DCR 患者携带P2Y12 等位基因C 或T 与NCR 及CNCR 患者携带等位基因C 或T 频率比较差异无统计学意义(P＞0.05)。CR 及DCR 患者与NCR 及CNCR 患 者CYP2Y19εA 频率比较差异有统计学意义(P＜0.05)，提示CYP2Y19εA 者CR 发生率高。CR 与DCR 患者比较，CYP2Y19εA 频率比较无明显差异(P＞0.05，见表5)。CR 及DCR 患者共存等位基因C 与A 频率高于NCR 及CNCR 患者，差异有统计学意义(P＜0.05);而共存T 与A、共存C 与G 及共存T 与G 频率差异无统计学意义(P＞0.05，见表5)。CR 与DCR 患者相比，共存等位基因C 与A 频率无明显差异(P＞0.05，见表5)。

表1 P2Y12 和CYP2Y19 等位基因分组患者一般资料的比较

表2 P2Y12 等位基因C 的临床特征学分析

表3 CYP2Y19 等位基因A 的临床特征学分析

表4 P2Y12 和CYP2Y19 等位基因或共存基因各组不同时间段血小板集率的比较

表5 CR、NCR、DCR、CNCR 各组患者基因型和等位基因频率的分析

3 讨论

CR 受多方面因素影响，主要有基因多态性、个体差异、药物的相互作用等［4，6，9，10］。其中基因多态性与CR 的关系成为当今预防治疗的研究热点，尤其P2Y12、CYP2C19 的基因多态性。最近相关研究显示［11］P2Y12 及CYP2C19 受体的生理作用较为广泛，影响着血栓形成的多个病理机制过程，如血小板聚集、血脂代谢等。其他相关研究显示［12］，在脑梗死的二级预防中，抗血小板药物的贡献率仅次于降血压的治疗。

我们的研究显示P2Y12εC 患者服用氯吡格雷前、服用2 w 后、3 m 及6 m 后的PAR 与P2Y12εT 比较，差异无统计学意义。据报道［13］P2Y12 基因的突变会降低氯吡格雷的反应，但并非所有研究已确认P2Y12 基因与CR 之间的关系［14］。本研究也发现，CR 及DCR 患者P2Y12εC 的频率与NCR 及CNCR患者比较差异无统计学意义，且多态性基因型分布比较差异无统计学意义。单因素分析提示既往有DM、高LDL-C 及GHB 患者P2Y12 变异率较高，但多因素分析，仅LDL-C 为P2Y12εC 的临床学特征。从以上研究分析，P2Y12 基因多态性可能与脂质代谢的调节密切相关，同时，可能由于存在其他的ADP受体参与氯吡格雷生理作用机制，因此，P2Y12 基因多态性与CR 之间的关系不显著。

然而有趣的是CYP2Y19εA 患者在4 个时间段与CYP2Y19εG 患者比较，CYP2Y19εA 患者PAR 都较高，差异有统计学意义，表明CYP2Y19εA 与PAR有关，原因可能为此基因为代谢酶，其基因突变不仅会影响氯吡格雷的活性成分在体内的形成，还有可能降低降脂类、降压类等多种药物的代谢作用，从而增加血小板聚集，导致CR。CYP2C19 基因多态性已证实是CR 的一个独立危险因素［8］。最近［15］也发现CYP2Y19εA 患者降低了抗血小板聚集的作用，且MACCE 发生率也明显高于未携带者。同时相关研究显示［16］携带有缺陷性CYP2C19 等位基因的患者表现出较低的氯吡格雷反应，证实CYP2C19 的突变与CR 有关。同样，我们研究也显示CYP2Y19 基因，CR 及DCR 患者比NCR 及CNCR 患者CYP2Y19εA频率高，也就是说，CYP2Y19εA 者发生CR 或DCR风险较高。另外，本实验还发现既往有DM、LDL-C、血糖浓度及GHB 患者CYP2Y19 变异率高，这些与国内外文献报道基本一致［13］，而多因素分析显示LDL-C 及GHB 为CYP2Y19εA 的临床特征学因素，从而提示CYP2Y19εA 并具有高TG 及GHB 者，易发生CR 或DCR。

考虑单基因多态性对血小板功能的影响相对较弱。从而，共存两种基因变异可能更易发生CR。近来研究［14］已证实共存CYP2C19εA 与P2Y12εC 的患者与CR 相关。本研究首次评估共存基因多态性对脑梗死患者CR 和DCR 的影响，结果显示，共存CYP2C19εA 与P2Y12εC 者服用氯吡格雷前、服用2 w后的PAR 高于其它共存等位基因型，同时CR和DCR 患者共存等位基因C 与A 频率分别高于NCR 和CNCR 患者，相关研究结果提示我们共存CYP2C19εA 与P2Y12εC 者易出现CR，这与既往的研究一致［14］。虽然这4 组之间比较，3 m 后及6 m后的PAR 无统计学意义，这种现象表明，相比DCR、CYP2C19εA 与CR 的更密切。另外，在本研究还显示，DCR 与CR 比较，P2Y12εC、CYP2C19εA 的频率以及共存C 与A 无明显差异，而与NCR 或CNCR 比较，共存C 与A 者明显增高，提示遗传基因的因素在DCR 与CR 发生中的作用机制类似，且对DCR 的发生无特异性贡献。本研究在队列观察研究曾报道，脑梗死患者CR 的独立危险因素为糖尿病、TIA、高血压病药物使用、高胆固醇血症等，而DCR 的独立危险因素为高胆固醇血症［4］，而脂质代谢紊乱和长期高血糖恰好是突变基因的临床学特征。这些结果将为今后如何预防CR 和DCR 探索了新的思路，尤其对于DCR 的预防将可能更应该注重血糖和血脂代谢紊乱的调节治疗。

［1］Chen ZM，Jiang LX，Chen YP，et al.Addition of clopidogrel to aspirin in 45，852 patients with acute myocardial infarction:randomised placebo-controlled trial［J］.Lancet，2005，366:1607-1621.

［2］Sofi F，Marcucci R，Gori AM，et al.Clopidogrel non-responsiveness and risk of cardiovascular morbidity.An updated meta-analysis［J］.Thromb Haemost，2010，103:841-848.

［3］Zhou BR，Shi HT，Wang R，et al.Dynamic changes and associated factors of clopidogrel resistance in patients after cerebral infarction［J］.JNeurol，2013，260:2928-2937.

［4］Wang ZJ，Zhou YJ，Liu YY，et al.Impact of clopidogrel resistance on thrombotic events after percutaneous coronary intervention with drug-eluting stent［J］.Thromb Res，2009，124:46-51.

［5］Naylor AR.Letter by Naylor regarding article，Guidelines for the prevention of stroke in patients with stroke or transient ischemic attack:a guideline for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association［J］.Stroke，2011，42:385-386.

［6］The World Health Organization MONICA Project(monitoring trends and determinants in cardiovascular disease):a major international collaboration.WHO MONICA Project Principal Investigators［J］.J Clin Epidemiol，1988，41:105-114.

［7］Wiviott SD，Trenk D，Frelinger AL，et al.Prasugrel compared with high loading-and maintenance-dose clopidogrel in patients with planned percutaneous coronary intervention:the prasugrel in comparison to clopidogrel for inhibition of platelet activation and aggregation-thrombolysis in myocardial infarction 44 trial［J］.Circulation，2007，116:2923-2932.

［8］Lee JM，Park S，Shin DJ，et al.Relation of genetic polymorphisms in the cytochrome P450 gene with clopidogrel resistance after drug-eluting stent implantation in Koreans［J］.Am J Cardiol，2009，104:46-51.

［9］Mijajlovic MD，Shulga O，Bloch S，et al.Clinical consequences of aspirin and clopidogrel resistance:an overview［J］.Acta Neurol Scand，2013，128:213-219.

［10］Kavita K，Vinod K，Poonam P，et al.Polymorphisms of MDR1，CYP2C19 and P2Y12 genes in Indian population:effects on clopidogrel response［J］.Indian Heart J，2013，65:158-167.

［11］Li D，Wang Y，Zhang L，et al.Roles of purinergic receptor P2Y，G protein-coupled 12 in the development of atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2012，32:81-89.

［12］Hong KS，Yegiaian S，Lee M，et al.Declining stroke and vascular event recurrence rates in Secondary prevention trials over the past 50 years and consequences for current trial design［J］.Circulation，2011，123:2111-2119.

［13］Wang Y，Wang Y，Zhao X，et al.Clopidogrel with aspirin in acute minor stroke or transient ischemic attack［J］.N Engl J Med，2013，369:11-19.

［14］Tang XF，Zhang JH，Wang J，et al.Effects of coexisting polymorphisms of CYP2C19 and P2Y12 on clopidogrel responsiveness and clinical outcome in patients with acute coronary syndromes undergoing stent-based coronary intervention［J］.Chin Med J(Engl)，2013，126:1069-1075.

［15］Namazi S，Kojuri J，Khalili A，et al.The impact of genetic polymorphisms of P2Y12，CYP3A5 and CYP2C19 on clopidogrel response variability in iranian patients［J］.Biochem Pharmacol，2012，83:903-908.

［16］Liu XL，Wang ZJ，Yang Q.Impact of CYP2C19 polymorphism and smoking on response to clopidogrel in patients with stable coronary artery disease［J］.Chin Med J，2010，123:3178-3183.