siRNA转染浓度和时间对HeLa细胞ANXA5表达的抑制作用*

王小杰，王永为，曲银娥，李 欣△

(1.河北联合大学基础医学院，河北唐山 063009;2.承德医学院)

siRNA转染浓度和时间对HeLa细胞ANXA5表达的抑制作用*

王小杰1，2，王永为2，曲银娥1△，李 欣2△

(1.河北联合大学基础医学院，河北唐山 063009;2.承德医学院)

目的:优化靶向ANXA5的siRNA转染HeLa细胞的条件，为进一步研究ANXA5低表达对宫颈癌细胞生物功能的影响奠定基础。方法:将靶向ANXA5的siRNA转染HeLa细胞，设置不同的siRNA与脂质体的比值和转染时间，Western Blot检测ANXA5蛋白的表达。结果:siRNA与脂质体的比值为0.4:1时，转染入HeLa细胞72h后，HeLa细胞ANXA5蛋白的表达水平最低，即抑制作用最强。结论:siRNA与脂质体的比值和转染时间可影响HeLa细胞ANXA5的表达，存在最佳比值和转染时间。

siRNA;HeLa细胞;ANXA5;抑制作用

膜联蛋白A5(ANXA5)是一种钙离子依赖的磷脂结合蛋白，是膜联蛋白家族最重要的成员之一，它在各种组织和细胞中都有分布。有研究发现，ANXA5在宫颈癌中的表达明显高于正常宫颈组织，在宫颈癌细胞系HeLa细胞中亦有较高表达[1-2]。因此，若能有效抑制HeLa细胞中ANXA5的表达，进而观察ANXA5低表达时HeLa细胞生物学功能的变化，将对宫颈癌的发生、发展、侵袭、转移以及机制研究具有重要意义。本研究通过阳离子脂质体LipofectamineTM2000将靶向ANXA5的siRNA转染到宫颈癌细胞系HeLa细胞中，通过检测ANXA5蛋白表达的变化探讨了siRNA与脂质体的最佳比值和最佳转染时间。

1 材料与方法

1.1 材料 靶向ANXA5的siRNA由invitrogen公司设计合成，脂质体LipofectamineTM2000购自invitrogen公司，DMEM培养基购自美国GIBCO公司，无支原体胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，鼠抗ANXA5单克隆抗体购自Epitomics公司。

1.2 HeLa细胞培养 HeLa细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM中，置于含5% CO2的37℃细胞培养箱中培养。将细胞随机分为3组:siRNA干扰组(用脂质体转染靶向ANXA5的siRNA)、阴性对照组(用脂质体转染非特异性siRNA)和空白对照组(不做任何处理)。

1.3 细胞转染 按转染试剂说明:将1×105个细胞500μl接种于24孔培养板，要求细胞24h达到70%的密度。将适量siRNA及脂质体分别溶于一定量的无血清培养基中，混匀后室温放置20min以形成载体复合物，将复合物加入培养板中，混匀，细胞培养箱中培养6h后，更换新的培养基，继续培养。

1.4 Western Blot法检测HeLa细胞ANXA5蛋白的表达 收集各组HeLa细胞提取总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒检测浓度。每孔加入30μg总蛋白行SDS-PAGE电泳;电转膜;5%脱脂奶粉封闭2h;ANXA5单克隆抗体(1:1000)室温孵育2h;TBST洗膜;羊抗鼠二抗室温封闭1h;超敏化学发光(ECL)法获得结果;采用Quantity One-4.6.2软件分析目的条带与β-actin条带的灰度比值。

1.5 统计分析 采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，采用单因素方差分析和q检验进行均数间差异显著性的比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 siRNA与脂质体不同比值对HeLa细胞ANXA5表达的抑制作用 siRNA干扰组根据siRNA和脂质体(1μl/孔)的不同比值设置4个组:干扰组1-4，siRNA与脂质体的比值分别为0.5:1、0.4:1、0.33:1、0.29:1，转染48h收取蛋白。结果显示，siRNA与脂质体的比值为0.4:1时ANXA5蛋白的表达最低，即对ANXA5的抑制作用最强(见图1，表1)。

图1 siRNA与脂质体不同比值对ANXA5表达的抑制作用

表1 siRNA与脂质体不同比值时各组ANXA5与β-actin的灰度值比(±s，n=8)

表1 siRNA与脂质体不同比值时各组ANXA5与β-actin的灰度值比(±s，n=8)

与空白对照组比较:*P＞0.05;与阴性对照组比较:#P＜0.05;与其它3个干扰组比较:△P＜0.05

组别 ANXA5/β-actin干扰组1(0.5:1) 0.1250±0.3969#干扰组2(0.4:1) 0.0863±0.1097#△干扰组3(0.33:1) 0.1100±0.0100#干扰组4(0.29:1) 0.1800±0.0400#阴性对照组 0.3033±0.6505*空白对照组 0.3200±0.4648

2.2 不同转染时间对HeLa细胞ANXA5表达的抑制作用

取siRNA与脂质体比值为0.4:1时，分别于转染后24h、48h、72h、96h收取蛋白。结果显示，72h时ANXA5蛋白的表达最低，即抑制作用最强(见图2，表2)。

图2 不同转染时间对ANXA5表达的抑制作用(siRNA:脂质体=0.4:1)

表2 不同转染时间时各组ANXA5与β-actin的灰度值比(±s，n=8)

表2 不同转染时间时各组ANXA5与β-actin的灰度值比(±s，n=8)

与空白对照组比较:*P＞0.05;与阴性对照组比较:#P＜0.05;与其它3个转染时间比较:△P＜0.05

转染时间 ANXA5/β-actin 24h 0.8686±0.7704#48h 0.3367±0.0058#72h 0.0360±0.0069#△96h 0.0433±0.1155#阴性对照组 1.2600±0.2646*空白对照组 1.2650±0.1871

3 讨论

近年来，国内外学者对ANXA5与恶性肿瘤的相关研究发现，ANXA5在鼻咽癌、喉癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠腺癌以及大肠癌等多种恶性肿瘤组织中的表达都有不同程度的升高，且有研究者推断ANXA5的异常表达可能与恶性肿瘤的发生、发展、浸润以及转移有关[3-8]。关于ANXA5与宫颈癌的关系，有研究发现宫颈鳞癌组织ANXA5的表达明显高于正常宫颈组织，且与癌细胞的分化程度具有一定的相关性[1，9];ANXA5在宫颈癌细胞系SiHa和HeLa细胞中亦表现为高表达，且ANXA5过表达可抑制SiHa细胞增殖、促进其凋亡，ANXA5低表达对HeLa细胞的增殖没有明显影响，但可抑制其凋亡[2,10-12]。以上研究结果均提示ANXA5与宫颈癌的发生有关，并且可能通过影响宫颈癌细胞的生物学功能发挥作用。

为进一步探讨ANXA5表达的改变对宫颈癌细胞系HeLa细胞生物学功能的影响，拟采用脂质体介导ANXA5 siRNA转染HeLa细胞来降低ANXA5蛋白的表达，但考虑到影响抑制作用的因素有许多方面，不同的细胞转染条件不同。因次，本研究从siRNA与脂质体的比值和转染时间两个方面优化了转染条件，结果显示影响靶基因蛋白表达的因素主要有siRNA与脂质体的比值和转染时间，并发现ANXA5 siRNA与脂质体的比值为0.4:1时，转染入HeLa细胞72h后，对HeLa细胞ANXA5蛋白表达的抑制作用最强。本研究可为深入研究ANXA5与宫颈癌发生发展的关系提供实验依据。

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INHIBITING EFFECTS OF SIRNA TRANSFECTION CONCENTRATION AND TIME ON ANXA5 EXPRESSION IN HELA CELLS

WANG Xiao-jie, WANG Yong-wei, QU Yin-e, et al
(Basic Medical Sciences of Hebei United University, Hebei Tangshan 063009, China)

Objective:To optimize the conditions of siRNA targeting ANXA5 transfected into HeLa cells, so to provide bases for further studying effects of ANXA5 low expression on biological functions of cervical cancer cells.Methods:siRNA targeting ANXA5 was transfected into HeLa cells, with different ratios of ANXA5 siRNA and liposomes, and different transfection time. Western Blot was used to detect the ANXA5 protein expression in HeLa cells.Results:The ANXA5 protein expression in HeLa cells was the lowest (the inhibitory effects was the strongest) when the ratio of siRNA and liposomes was 0.4:1 and transfection time was 72h. Conclusions:The ratio of siRNA and liposomes and transfection time can inf l uence the expression of ANXA5 in HeLa cells, and has the best ratio and transfection time.

siRNA; HeLa cells; ANXA5; Inhibiting effects

R73-3

A

1004-6879(2014)01-0015-03

2013-07-23)

* 河北省科学技术研究与发展计划项目(10276142)

△ 通讯作者