细毡毛忍冬血清药物化学初步研究

付燕伟，黎豫川，陀扬凌，唐瑜，张旭

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细毡毛忍冬血清药物化学初步研究

付燕伟，黎豫川，陀扬凌，唐瑜，张旭

目的：对细毡毛忍冬乙醇提取物进行血清药物化学研究，为筛选确定细毡毛忍冬的药效成分奠定基础。方法：建立细毡毛忍冬乙醇提取物及大鼠含药血清、空白血清的HPLC指纹图谱分析方法；通过比较细毡毛忍冬乙醇提取物、含药血清及空白血清指纹图谱，确定其血清移行成分。结果：在含药血清中发现了8个移行成分，其中2个为原型成分，6个是代谢产物。结论：血中移行成分和代谢产物可能成为细毡毛忍冬的体内直接作用物质，对其更深入的研究有助于探索其药效物质基础及作用机制。

细毡毛忍冬；血清药物化学；移行成分

中药血清药物化学是以传统药物化学研究方法和手段为基础, 综合应用多种现代技术, 分析鉴定中药口服后血清中的移行成分, 研究其药效相关性，确定中药药效物质基础并研究其体内过程的应用学科[1]。通过中药血清药物化学研究, 确定中药的体内直接作用物质, 为阐明中药及其复方药效基础提供可靠的实验依据。细毡毛忍冬为忍冬属植物细毡毛忍冬Lonicera similes Hemsl的干燥花蕾或初开的花(习称长吊子银花)， 具有清热解毒之功效，为川产金银花的

1 实验材料

1.1 药品与试剂

细毡毛忍冬药材购自荷花池中药材市场，经成都中医药大学马逾英教授鉴定为 Lonicera similes Hemsl的干燥花蕾。甲醇(成都市科龙化工试剂厂，分析纯)；乙酸(成都市科龙化工试剂厂，分析纯)；甲醇( 美国天地公司，色谱纯)；乐百氏纯净水；乙腈( 美国天地公司，色谱纯）。芦丁对照品( 中国药品生物制品检定所，批号:100080-200707 ) ， 绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号110753-200413）。

1.2 实验仪器

安捷伦1200高效液相色谱仪；DAD检测器；KQ-500DE超声波清洗机(昆山市超声波仪器有限公司)；TGL-16G高速离心机(上海安亭科学仪器厂); 微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器有限公司)。Sartorius型电子分析天平( 赛多利斯科学仪器( 北京) 有限公司)；RE-52型旋转蒸发仪(上海亚荣生化有限公司)。

1.3 实验动物

雌性SD大鼠，SPF级，体重( 200 g±10g)，购自于达硕公司，动物合格证号 SCXK（川）2009-124。

2 实验方法

2.1 细毡毛忍冬乙醇提取物的制备

取细毡毛忍冬药材1kg粉碎，用50%乙醇水浴回流提取3次。减压回收乙醇制成1g/mL的提取液，冷藏备用。

2.2 细毡毛忍冬乙醇提取物供试品的制备及对照品的配制

取0.5mL的上述提取液，水浴蒸干，加甲醇100mL，溶液过0.45μm微孔滤膜，得供试品试液。准确称取芦丁标品0.0050g ，用 95%乙醇溶解，并完全溶解后转入25mL容量瓶中，用95%乙醇定容，配成0.20mg/mL的芦丁标准溶液。精密称取绿原酸对照品0.0040g，用50%甲醇溶解，转移至10mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，配制成0.4mg/mL的绿原酸对照品溶液。

2.3 空白血清和含药血清样品的制备

取SD大鼠，禁食12h（自由饮水），按1mL/100g体重分别灌胃提取液。给药一小时后经大腿股动脉取血，于3000r/min转速离心5min，用微量移液枪吸取0.4mL含药血清于离心管中加入1.2mL甲醇，涡旋混匀10min，12000r/min转速离心5min，取上清液氮气吹干加100μL色谱甲醇溶解，12000r/min转速离心5min，取上清液20μL供HPLC分析用。同法制得空白血清供试品。

2.4 色谱条件

色谱柱：Scienhome C18柱（250 mm x 4.6 mm，5 μm）；柱温：25 ℃; 检测波长:280 nm；流动相: A( 0.5%乙酸水溶液)，B(乙腈)；流速: 1mL/min；梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

2.5 细毡毛忍冬乙醇提取物及其含药血清定性分析

取细毡毛忍冬乙醇提取物供试液及含药血清样品在相同的色谱条件下行HPLC分析, 建立HPLC图谱, 比较鉴定其血中移行成分。

3 结果与讨论

3.1 结果

细毡毛忍冬乙醇提取物、含药血清及空白血清HPLC色谱图见图1。

图1 样品HPLC图

细毡毛忍冬给药后检测出了8个血中移行成分，通过保留时间与紫外吸收光谱图与体外样品比较可知3号（绿原酸），5号峰为原型成分，经口服后可直接吸收入血。其余6个峰为代谢产物或是应激产物。8个血中移行成分紫外光谱图见图2-9。

图2 特征峰1（tR=8.305min)

图3 特征峰2（tR=9.832）

图4 特征峰3（tR=12.645min)

图5 特征峰4（tR=16.852min）

图6 特征峰5（tR=19.025min）

图7 特征峰6（tR=22.852min）

图8 特征峰7（tR= 24.765min）

图9 特征峰8（tR=35.618min）

3.2 讨论

比较不同波长下的色谱图，以280 nm处所得图谱的色谱峰指纹信息最多，色谱峰形状和各峰的分离度较好，并且杂质峰较少。因此选定280 nm处所得色谱图进行比较。

在不同的血清处理方法中，本实验采用甲醇沉淀法处理血清的步骤少且杂质峰较少，峰形较好。在给药一小时后色谱峰指纹信息最多，故在给药一小时后取血。

细毡毛忍冬所含化学成分复杂，主要为有机酸及黄酮类，在体内吸收较差，给血清分析带来困难，故先浓缩一定倍数再进样分析。

现代医学认为，方药的任何功效都有其体内直接作用的物质基础，因此本实验中产生的8个血中移行成分，应该是“清热解毒”功效的物质基础，建立这些成分的现代药理作用与“清热解毒”的关系，有助于阐明“清热解毒”功效的本质。本实验只是对入血成分进行初步分析，仅从数目的角度进行了定性描述，对入血成分的归属应当采用LC-MS进行分析。中药一般药效成分复杂，用某一种化学成分体内的量变规律很难反映中药疗效的时间变化过程，难以体现中医药理论体系的整体观念。尝试用给药前后的血清指纹图谱，从整体上考察体内吸收和代谢过程，不只是考察其中的某些化学成分，亦可对中药药代动力学研究提供一种新的尝试。

[1] 王喜军.中药及中药复方的血清药物化学研究[J].世界科学技术-中药现代化, 2002, 4 (2) : 1.

[2] 四川省卫生厅.四川省中药材标准[S].1987.

[3] 湖南省卫生厅.湖南省中药材标准[S].1993.

[4] 贵州省卫生厅.贵州省中药质量标准[S].1988.

（责任编辑: 胡慧玲）

Primary research on serum pharmacochemistry of Lonicera similes Hemsl.

FU Yan-wei, LI Yu-chuan, TUO Yang-ling, TANG Yu, ZHANG Xu//( Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine; State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources Co-founded by Sichuan Province and MOST, Chengdu 611137, China)

Objective:To screen and identify the medicinal ingredients through the research on serum pharmacochemistry of ethanol extract of Lonicera similes Hemsl.Method:The HPLC fngerprints analytical methods of ethanol extract of Lonicera similes Hemsl. was built up. Serum transitional components were identifed through comparing the fngerprints of ethanol extract, rat serum-containing active components and blank serum.Result:8 transitional ingredients were obtained. Two of them were prototype components, and the others were metabolites.Conclusion:Serum transitional components and the metabolites may be active ingredients that directly work in the body. Further research will be benefcial to explore the material basis of effcacy and action mechanism of Lonicera similes Hemsl.

Lonicera similes Hemsl.; serum pharmacochemistry; transitional ingredients

R 284

A

1674-926X(2014)04-003-02

四川省教育厅重点项目（2010A036）

成都中医药大学药学院 教育部中药材标准化重点实验室 中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137

付燕伟（1988-），男，硕士在读，主要从事中药化学和中药质量控制研究Email:969299927@qq.com

张旭（1960-），男，副教授，博士，主要从事中药化学和中药质量控制研究

2013-12-10主流品种，种植广，产量大，在四川、湖南、贵州省中药材标准中收载[2～4]。近年来对其质量标准，化学成分研究等方面有了更多的报道，但其体内作用成分及代谢过程研究还未见报道。因此作者采用血清药物化学研究方法, 应用色谱指纹图谱分析等手段对此进行了初步探讨。