黄药子及配伍甘草对大鼠肝脏CYP450基因表达的影响

华碧春，黄智锋，刘娇，程心玲，陈小峰，王英豪，卓实

·药理毒理·

黄药子及配伍甘草对大鼠肝脏CYP450基因表达的影响

华碧春1，黄智锋1，刘娇1，程心玲2，陈小峰3，王英豪1，卓实2

目的：考察甘草对黄药子引起的肝损伤的CYP450酶基因表达的影响。方法：采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）技术检测大鼠肝脏CYP1A2、CYP2C19的mRNA的表达。结果：在mRNA水平上，28天、35天黄药子组均显著诱导CYP1A2的基因表达，配伍甘草后表达降低，具有统计学意义。甘草组可微弱下调CYP2C19的表达，但与配伍组相比无统计学意义。结论：甘草通过抑制CYP1A2的mRNA表达，对黄药子致肝损伤具有一定保护作用。

黄药子；甘草；CYP450；基因表达；配伍减毒

中药致肝损害已成为我国中药安全性评价面临的重要问题。据不完全统计，世界范围内有包括草药和非法药物在内的大于1100种的药物可引起肝损害[1]，国内已报道有100 多种中草药和30 多种中成药可引起肝损害[2]。肝脏是大部分药物转化代谢的场所，有研究表明药物性肝损害的发生与肝组织内细胞色素P450的高表达密不可分[3]。本实验以前期实验[4～6]为基础，通过大鼠肝脏CYP450基因mRNA表达的影响来探究黄药子甘草1∶2配伍组减轻黄药子致大鼠肝损伤时间蓄积性的实验机制。

1 材料

1.1 药品与试剂

黄药子饮片，产地四川，批号120724，购自福建回春医药连锁有限公司，经福建中医药大学药学院中药鉴定教研室卢伟教授鉴定为薯蓣科植物黄独Dioscorea bulbifera L.的块茎。甘草饮片，产地甘肃，批号12030506，购自福建回春医药连锁有限公司，经福建中医药大学药学院中药鉴定教研室卢伟教授鉴定为豆科植物胀果甘草Glycyrrhiza infata Bat.的干燥根和根茎。

Trizol（Lot:15596-026，Invitrogen），RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (RT-PCR，Lot: 00102205，Fermentas)，DreamTaq™ Green PCR Master Mix (Lot: 00124582，Fermentas) ，50bp DNAmarker（Lot:1304G15，上海捷瑞生物工程有限公司） CYP1A2、CYP2C19、β-actin引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。异丙醇、氯仿、无水乙醇等均为国产分析纯。

1.2 实验动物

雄性SD大鼠，SPF级，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2012-0002。

1.3 实验仪器及设备

核酸蛋白测定仪（德国Eppendorf）、PCR扩增仪（S1000TM Thermal Cycler 美国BIO-RAD）、冷冻台式高速离心机（德国Eppendorf）、电泳仪（美国BIO-RAD）、全自动凝胶成像系统（Gel DocTM XR+ Imaging System美国BIO-RAD）。

2 方法

2.1 药液制备

黄药子饮片烘干，粉碎，8倍量水浸泡60 min，煎煮60 min；2次煎煮5倍量水煎煮30 min，合并2次药液；过滤，经3000 r．min-1离心 10 min，除去药渣，再次浓缩至1 g．mL-1（以黄药子生药量计，下同）。黄药子甘草1∶2配伍组(后文简称“配伍组”)合煎液同法煎煮制备，浓缩至1 g．mL-1。

2.2 动物分组及给药

雄性SD大鼠，体重200±20 g，随机分为6组，按给药剂量： 9 g．kg-1（黄药子组）、9 g．kg-1（配伍组，黄药子生药量）和空白对照组（等体积蒸馏水）。分别于灌胃28天和35天处死，迅速取出肝脏，置液氮中保存。

2.3 CYP1A2、CYP2C19 mRNA表达

应用Invitrogen公司的TRIzol®试剂、氯仿及异丙醇试剂提取大鼠肝脏组织中的总RNA，测得A260/ A280比值1.8～2.0，所提总RNA可用。逆转录反应以Fermentas公司的RT-PCR试剂盒说明书操作，逆转录条件为42℃ 60 min、70℃ 5 min，合成第一条cDNA链。PCR反应以逆转录产物1.0 μL为模板，加入上下游引物各0.8 μL，Green PCR Master Mix 10 μL，Rnase-free H2O 7.4 μL，使反应终体积为20 μL。PCR反应条件为：95℃预变性3 min；循环时95℃ 30 s，CYP1A2、β-actin 53℃退火30 s、CYP2C19 47℃退火30 s，72℃延伸30 s；扩增的循环数分别为35、35、32；最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳并与DNA标准分子量比较鉴定后，在数字成像仪拍照、分析。特异性引物序列见表1。

表1 CYP 1A2、CYP2C19、β-actin基因引物序列信息

2.4 统计学处理

3 结果

由表2、图3可见：与空白组比较，28天、35天黄药子组均上调了CYP1A2的mRNA的表达（P＜0.05或P＜0.01），且35天组较28天组诱导作用更显著（P＜0.01）；与黄药子组比较，28天、35天配伍组抑制了CYP1A2的mRNA的表达（P＜0.05或P＜0.01），具有统计学意义；28天、35天黄药子组、配伍组上调了CYP 2C19 的mRNA的表达，但表达无明显差异，无统计学意义。

表2 黄药子及配伍甘草对大鼠肝脏CYP450亚型mRNA表达水平的影响（）

表2 黄药子及配伍甘草对大鼠肝脏CYP450亚型mRNA表达水平的影响（）

注：与对应天数空白组比较 a P＜0.05，c P＜0.01，e P＞0.05；与对应天数黄药子组比较 b P＜0.05，d P＜0.05，f P＞0.05

组别 CYP1A2/β- actin CYP2C19/β- actin 动物数（n）28天黄药子组 2.415±1.432a 1.358±0.955e 10 28天配伍组 1.053±0.261b 1.099±0.677f 9 28天空白组 1.082±0.175 0.743±0.503 8 35天黄药子组 2.283±1.032c 1.350±0.420e 10 35天配伍组 1.325±0.561d 1.015±0.358f 9 35天空白组 1.232±0.586 0.985±0.395 8

图3 不同处理组CYP1A2、CYP2C19 PCR产物凝胶电泳结果

4 讨论

4.1 中药配伍理论作为中医药理论的重要组成部分，已有几千年的应用历史，配伍减毒更是临床常用的有效手段。配伍后的作用机制已成为近几年中药现代化研究的热点，本研究正是应用RT-PCR技术检测肝脏CYP450酶mRNA的表达影响，探讨甘草减轻黄药子肝毒性的作用机制。

4.2 现代药理学认为，CYP450 酶的诱导或抑制是药物相互作用最常见的原因之一。CYP1A2与药物代谢关系较为密切，其占肝脏总P450氧化酶含量的13%，仅次于CYP3A和CYP2C家族，参与了黄曲霉毒素B1、多环芳烃等前致癌物以及咖啡因、非那西丁硝苯地平、丙咪嗪等20 余种药物的代谢活化过程，其在内源性底物和环境毒素的代谢过程中起到了重要作用；CYP 2C家族占成人肝微粒体CYP450总量的20%左右，能代谢巴比妥类、丙咪嗪、奥美拉唑、华法林等药物，多数内源性底物、前致癌物、前毒物、临床大约2%的药物的代谢及毒性反应与CYP2C19相关。文献报道[7]，黄药子的不良反应主要是引起肝损害，且其对肝脏的损害属于对肝细胞直接毒性作用。因此，通过CYP1A2、CYP2C19的mRNA的表达研究甘草减轻黄药子致肝脏毒性损害及临床合理应用黄药子具有重要意义。

4.3 本研究结合传统中医药配伍理论，结合前期实验基础以及文献资料的报道，同时根据临床病例长期、大量服用黄药子及其制剂的特点，通过大鼠肝脏CYP1A2、CYP2C19的mRNA表达的影响探究黄药子甘草1∶2配伍组减轻黄药子致大鼠肝损伤时间蓄积性的实验机制。28天、35天黄药子组均显著上调了CYP1A2的mRNA表达，配伍甘草后CYP1A2的mRNA表达降低。提示甘草可能通过抑制CYP1A2的mRNA表达，对黄药子致肝损伤有保护作用。28天、35天黄药子组对CYP2C19基因表达有一定诱导作用，然配伍甘草后表达微弱下降，但与黄药子组相比，无统计学差异。可见CYP2C19虽与多数内源性底物、前致癌物、前毒物代谢及毒性反应有关，但该基因并不参与黄药子致肝损伤的调控；抑或是因为CYP2C19存在遗传多态性，存在多个等位基因，黄药子致肝损伤是否与CYP2C19多态性等位基因的mRNA表达有关，还有待进一步研究。4.4 CYP450酶作为药物代谢重要酶系，在中药配伍增效减毒上起着重要作用。黄药子苦寒，攻散之性较强，治疗癌肿、甲状腺疾患用药时间长，易耗正气；甘草能缓和黄药子苦寒之性，补脾益气、保肝利胆、清热解毒。本实验从基因水平探讨黄药子肝损伤及配伍甘草减毒的机制，丰富和发展了中药甘缓解毒的药性理论和相畏、相杀的配伍理论，为临床合理应用黄药子提供了实验依据。下阶段，我们将继续对CYP1A2、CYP2C19酶含量和活性及蛋白表达的影响深入研究，同时增加与肝损伤相关的CYP亚型的实验，以阐明黄药子致肝损伤的机制及甘草减轻黄药子肝毒性的作用机制。

[1] Jonathan G Stine,James H Lewis.Durg-induced liver injury: a summery of recent advances[J].Expert Opin.Drug Metab. Toxicol,2011,7(7):875.

[2] 华碧春,卢榜华.中草药的药物性肝损害[J].福建中医药大学学报,2000,10(1):30.

[3] Pelkonen O,Raunio H.Metabolic activation of toxins: tissuespecifc expression and metabolism in target organs[J].Environ Health Perspect,1997,105:767.

[4] 华碧春,胡娟,王瑞国,等.甘草降低黄药子致小鼠肝毒性的实验研究[J].世界中西医结合杂志,2011,6(1):24.

[5] 华碧春,马丽娜.黄药子配伍甘草分煎液与合煎液中黄独乙素含量的比较[C].第五届全国临床中药学学术研讨会论文集,2012:215.

[6] 华碧春,卓实,史道华,等.甘草减轻黄药子肝毒性的实验研究[J].福建中医药大学学报,2013,23(1):23.

[7] 唐迎雪.黄药子古今临床应用研究[J].中国中药杂志,1995,20 (7):435.

（责任编辑：陈思敏）

Effects of the compatibility of Huangyaozi and Gancao on the CYP450 mRNA expression in rat liver

HUA Bi-chun1, HUANG Zhi-feng1,LIU Jiao1, CHENG Xin-ling2, CHEN Xiao-feng3, WANF Ying-hao1,ZHUO Shi2//(1.School of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122; 2.The First Affliated Hospital of Fujian Province, Fuzhou 3500042; 3.The Second People’s Hosptial of Fujian Province, Fuzhou 3350003)

Objective:To study the effects of the compatibility of Huangyaozi and Gancao on the CYP450 mRNA expression in rat livers.Method:The mRNA levers of the expression of the CYP1A2 and CYP2C19 gene of the rat liver were assayed with RT-PCR. Result: The mRNA levels of CYP1A2 were induced signifcantly by group of Huangyaozi after medication for 28 days and 35 days separately and reduced after given the compatibility with Gancao. Conclusion: The mRNA expression of CYP1A2 was inhibited by Gancao to protect liver from injury which caused by Huangyaozi.

Huangyaozi; Gancao; CYP 450; gene expression; decrease toxicity by compatibility

R 285.5

A

1674-926X(2014)04-005-03

国家自然科学基金项目（No：81274105）

1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.福建省人民医院，福建 福州 350004；3.福建省第二人民医院，福建 福州 350003

华碧春(1962- )，女，主要从事中药学研究Email:1625399195@qq.com

2013-10-21