慢性伤口细菌生物膜的临床识别和影响因素的研究进展

徐元玲综述，王建东，蒋琪霞审校

0 引 言

慢性伤口因持续时间长、影响因素多而易发感染甚至形成难以处理的细菌生物膜，增加了治疗难度，影响愈合效果［1］。临床多见于压疮、糖尿病足溃疡、下肢动静脉溃疡等慢性伤口［2］。如何识别细菌生物膜及其病原菌是临床有效干预的前提，文中就慢性伤口细菌生物膜的临床识别和生物膜形成的影响因素进行综述。

1 慢性伤口细菌生物膜临床识别

1.1 细菌生物膜感染的检测识别技术 慢性伤口细菌生物膜就是细菌附于伤口床，与自身分泌的细胞外基质成分相互融合形成的一种膜状组织［1］。由于其结构微小，肉眼难以识别，临床上通常使用细菌培养来检测伤口中存在的细菌。细菌培养对诊断急性伤口感染相当准确，但对于细菌生物膜引发的慢性感染的诊断却并不可靠［3］。传统的细菌培养取样用无菌拭子擦拭伤口床获取分泌物样本，由于细菌定植部位的隐蔽性，大量厌氧菌隐藏于伤口深部组织，无菌拭子并不能充分全面地触及伤口基底，因此培养结果通常无法发现厌氧菌存在［4］。有研究发现，在生物膜感染病例中，阴性培养结果常与明显的感染症状和体征不符，造成这一现象的原因可能与样本取材不充分、培养时间不长或培养基中养分缺乏有关［5］。此外，细菌培养是采用实验技术方法使细菌生长繁殖，培养过程中易受污染，且耗时长、特异性差、敏感度低，易导致假阴性或假阳性结果，所以传统细菌培养技术常会低估慢性伤口中细菌数量和种类。为提高慢性感染性疾病生物膜内细菌的检出率，现已发展出一些新的检测手段，如聚合酶链反应、荧光原位杂交技术、变性梯度凝胶电泳及16S核糖体核糖核酸序列分析等分子生物技术［6］。这些技术主要是对细菌染色体或染色体外的DNA片段进行分析，从遗传进化的角度和分子水平进行细菌分类鉴定，从而使细菌分类更科学、更精确，特别是分子技术花费时间短，通常24h即能反馈细菌培养结果，为临床有针对性的伤口干预措施提供有效证据。另有研究发现，通过传统细菌培养方法和革兰氏染色法在分泌性中耳炎患者耳腔中检测到的细菌阳性率低于30%，而使用分子生物技术检测阳性率则高达90%以上［7］。因此，分子生物技术的发展大大提高识别菌膜感染的准确性和科学性。

1.2 细菌生物膜感染的实验和临床诊断标准

1.2.1 细菌生物膜感染的实验诊断标准 Parsek等［8］提出了通过检测临床相关标本诊断生物膜感染的Parsek-Singh实验诊断标准，具体包括:①与伤口表面相关的细菌感染;②获取的伤口组织病理检查见细菌聚集并包被于基质中;③感染局限于宿主的某一特定部位，伴或不伴全身感染;④细菌对敏感抗生素产生耐药性。基于生物膜感染的抗生素耐药特性和抗宿主免疫反应的特性，Stoodley等［9］在2008年建议对上述生物膜感染的诊断标准作如下2点补充:①应用细菌直接活力染色法结合分子诊断学技术如逆转录聚合酶链式反应或荧光原位杂交技术证实有活性细菌聚集物的存在;②宿主组织中散在分布有细菌聚集群(大菌落)并伴炎性细胞浸润，证明宿主无有效清除细菌的能力。

1.2.2 细菌生物膜感染的临床诊断标准 既往研究报道，细菌生物膜感染病例的临床特征包括:苍白的伤口床，黄色渗液，坏死组织，清亮组织液，有腐臭味，脆弱的肉芽组织及细菌培养结果［10］。通常当伤口出现上述特征之一时，建议在严格无菌操作下取组织活检或行细菌培养，再使用激光扫描共聚焦显微镜观察到包裹在细菌表面的胞外多糖物质，这是诊断生物膜存在的重要阳性特征［11］。目前对可疑病例采用分子技术准确快速识别伤口中的细菌生物膜已成为研究热点。未来需要根据临床表现结合实验结果，制定更为明确可行的细菌生物膜诊断标准。

1.3 慢性伤口细菌生物膜中的细菌识别结果 慢性伤口细菌生物膜中细菌种类繁多，通常有3～10种占主导地位的微生物，另有数以百计的其他不同类微生物，且不同类型的慢性伤口，其细菌生物膜内所含细菌亦不相同［12］。

过往研究对不同类型的慢性伤口提取标本，使用细菌标记的焦磷酸扩增测序法(Bacterial tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing，bTEFAP)检测和总结出伤口生物膜中的细菌种类和分布规律［12］。Dowd等［12］在2008年收集了40例不同糖尿病足溃疡患者伤口清创物质的标本，通过提取DNA，使用bTEFAP技术检测观察，结果发现棒杆菌属最常见的厌氧菌，其它细菌包括沙雷氏菌、链球菌、金葡菌及肠球菌等。Wolcott等［13］在2009年观察了40例慢性下肢静脉性溃疡生物膜中的细菌分布，主要为金黄葡萄球菌、链球菌、假单胞菌、沙雷菌、棒状杆菌属、大肠埃希菌、凝固酶阴性的葡萄球菌、真菌和厌氧菌等，还有许多尚不知名的细菌，其中 兼性厌氧菌占51%，专性厌氧菌占30%。Smith等［14］在2010年对49例压疮组织样本进行检测，主要为链球菌、棒杆菌属、金黄色葡萄球菌、厌氧菌及假单胞菌等共212个菌属，487个细菌种类，其中厌氧菌占31%，兼性厌氧菌占43%。

伤口感染是多种细菌共同作用的结果，特别是厌氧菌的存在，尽管数量微小，却可能破坏伤口正常生理愈合机制［15－16］。因此，在临床伤口处理中需要特别关注类如外口小内腔大的压疮伤口、窦道等无氧环境下有无厌氧菌或兼性厌氧菌的生存，如有可疑，建议取深部组织送分子病理检测，同时局部使用3%过氧化氢溶液冲洗，与局部充分作用后再用等渗盐水二次冲洗，填充或覆盖广谱抗菌的银敷料抑制其生长繁殖［17］，且每周至少跟踪评价2次临床效果，每2－3周跟踪评价细菌检测结果。

2 慢性细菌生物膜形成的影响因素

在伤口由急性转为慢性的过程中，细菌受到各种因素影响，如极度营养缺乏或过剩、低pH值、高渗透压、氧化、抗菌剂和抗生素使用等，这些因素与生物膜的形成与否密切相关。

2.1 pH值 体外实验发现变异链球菌在pH=7.0时12～24h内即可形成稳定的生物膜，该生物膜还能抵抗pH=5.0的酸性环境［18］。还有细菌形成的生物膜能抵抗碱性环境，如粪肠球菌能在pH值为7～9的碱性环境中形成稳定的生物膜［19］。但在过酸(pH＜5.0)和过碱(pH＞9.0)的环境中生物膜均不能生长［20］。生物膜有此特性可能与其结构有关，细菌生物膜是由细胞外基质包裹的细菌群体相互粘附形成三维立体结构，在这种状态下，酸碱成分只对膜内表层细菌有影响，而无法对深层细菌发挥作用［21－22］。其次，生物膜中营养成分的浓度由外向内呈现梯度下降，致使深层细菌长期处于营养缺失状态而生长缓慢，对酸碱的敏感性也降低，表层菌脱落后代谢产物的积聚也容易有效抵御酸碱的快速渗透。

伤口修复过程中肉芽组织生长需弱酸性环境，碱性环境不仅不利于肉芽组织生长，且有可能激活基质金属蛋白酶，造成伤口组织自噬。我们怀疑生物膜与肉芽生长的弱酸性环境相竞争，从而抑制肉芽组织的生长。有文献报道，建议酸化菌膜定植的慢性伤口，营造适宜于肉芽组织生长又能控制菌膜的伤口pH微环境，促进伤口组织修复［23］。但需要更多临床试验证实伤口pH值与生物膜形成的相关性。

2.2 温度 温度也是影响细菌生物膜形成的一个重要因素。体外实验发现随着温度的不断升高，细菌生物膜形成速度加快，但超过40℃时稳定性逐渐降低，30℃ ～35℃是细菌形成生物膜的合适温度［20］。而此温度又是伤口组织生长需要的适宜温度，推测在温度方面生物膜也与肉芽组织存在竞争性抑制。临床上使用物理干预辅助治疗伤口，如远红外线通过热辐射效应，能提升伤口温度2℃ ～3℃(33℃ ～35℃)，可促进伤口局部血液循环达到消炎消肿，减轻疼痛的作用，还可促进胶原形成和成纤维细胞增殖而促进伤口愈合［24］。此结果引发思考:热辐射提升伤口温度后对生物膜形成有何影响?是否肉芽组织良好生长能够抑制生物膜的生长?如果存在这种竞争性抑制，通过什么途径调控?上述问题还有待进一步研究。

2.3 抗生素和疾病 抗生素治疗细菌生物膜历来存在争议，有文献报道，抗生素虽然可杀灭链球菌，但却促进铜绿假单胞菌和沙雷菌等其他细菌形成生物膜，这些细菌定植于伤口的深层，抗生素难以发挥作用，导致细菌持续存在从而延缓伤口的愈合［25］。疾病也能影响细菌生物膜生存与否，如糖尿病患者伤口中的链球菌是非糖尿病的63倍［25］。

2.4 细菌基因蛋白改变对生物膜形成的影响 细菌间可利用结合、转化和转导进行基因交换，使浮游细菌有能力形成生物膜［26］。生物膜成熟过程中约35%基因表达发生改变，如铜绿假单胞菌生物膜的形成过程中蛋白发生变异的多达800余种，增加了临床处理难度［27］。细菌定植部位也影响基因活性，铜绿假单胞菌定植部位距离伤口表面通常大于金黄色葡萄球菌，但通过分泌酰基高丝氨酸和鼠李糖脂，可使机体激活巨噬细胞的能力减弱，中性粒细胞凋亡速度加快，且激活基质金属蛋白酶，产生对伤口组织的自噬作用从而影响伤口愈合［28］。生物膜中的细菌还可互相利用其优点达到共生目的，金黄葡萄球菌利用白色念珠菌的菌丝穿透上皮层而达到黏附、入侵破坏组织的目的，两者互相影响基因和蛋白的表达，共同促进形成生物膜，抵抗机体免疫和抗生素治疗［29－30］。协同生长增加了生物膜的致病性，早期定植细菌的代谢产物可成为晚期定植细菌生存的基床，所以细菌生物膜结构坚实稳定，不易被破坏［31］。

3 结 语

目前关于伤口细菌生物膜的研究以体外研究为主，得到的大多为实验数据，未来需要进一步在临床实验得到验证，且患者个体差异性是否影响生物膜形成尚需进一步研究。此外，临床在标本收集，预处理及技术检测分析等方面还有待于统一操作流程和加以规范，避免污染以提高检测结果的准确性。

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