VITEK-Ⅱ全自动微生物鉴定系统在室间质评中的应用研究及对策

刘 杰，赵满仓，周海峰

(北京军区总医院检验科，北京100700)

检验科细菌室室间质评是评价实验室水平的重要手段，选用合适的细菌鉴定系统是提高室间质评成绩的保证。近年来随着自动微生物检测技术的迅速发展[1]，各级医院逐步将VITEK系列应用于细菌室的鉴定和药物敏感性试验[2]。VITEK-Ⅱ是一种由电脑控制的全自动微生物鉴定系统，它能分别或同时完成临床微生物的鉴定和药物敏感性试验等。本室将北京检验中心发放的76株质控菌用VITEK-Ⅱ与传统手工法API进行对照鉴定，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器及套试剂 VITEK-Ⅱ全自动微生物分析仪及鉴定卡，API微生物鉴定条及配套试剂均购自法国梅里埃生物公司。羊血琼脂平板、伊红美蓝平板、SS琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板、沙保罗琼脂平板购自英国OXOID公司。

1.1.2 室内质控菌株 美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)质控菌株大肠埃希菌(ATCC25922)、铜绿假单胞菌(ATCC 27853)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、白色念珠菌(ATCC90028)购自北京天坛药物生物技术开发公司。

1.1.3 诊断血清 沙门菌属诊断血清，志贺菌属诊断血清，肠道致病性大肠埃希菌诊断血清，均由兰州生物制品研究所生产;肠道侵袭性、产毒性大肠埃希菌诊断血清，由成都生物制品研究所生产。

1.1.4 室间菌株 北京市检验中心发放的2008年3月至2012年10月质控菌共75个标本76株质控菌(其中菌株批号为2011-3-A2的为两种细菌的混合菌标本)。其中45株革兰阴性杆菌，包括肠杆菌科细菌29株，非发酵菌14株，弧菌科1株，博德特菌属1株;18株革兰阳性球菌，包括葡萄球菌8株，肠球菌3株，链球菌6株，片球菌属1株;7株真菌;6株其他细菌，包括厌氧菌3株，革兰阳性杆菌3株。

1.2 方法

1.2.1 菌种准备 ①冻干ATCC菌株:在冻干菌种管中加入0.2 mL新鲜牛肉汤或无菌小牛血清，充分摇匀，分别接种于血琼脂、伊红美蓝平板、SS琼脂、麦康凯琼脂平板(置于35.0℃)、沙保培养基(置于30.0℃)孵育24～28 h。②平板培养基菌株:根据标本来源，如血、尿、脓、分泌物直接挑取单个菌落接种在羊血琼脂平板、伊红美蓝平板、沙保罗琼脂上。大便标本接种在SS琼脂平板、伊红美蓝平板、沙保罗琼脂上，35℃下培养18～24 h。

1.2.2 鉴定方法 ①传统API方法:根据菌落形态、革兰染色接种相应的API微生物鉴定条。②VITEK-Ⅱ鉴定法:按VITEK-Ⅱ仪器说明书，根据革兰染色，配制成一定浓度的细菌悬液，分别填充GP等鉴定卡，然后上机封口进行培养。

1.2.3 鉴定结果准确性判断 API和VITEK-Ⅱ用鉴定百比率(%Id，概率，指示出不同菌类的比较)和T值(Tindex，指示出在同一个菌类的相似程度)表示生化结果组合与资料库內的典型条目(Taxa)做出比较，来指示检测可信度的评价。依据T值及%Id的组合，做出评语:ⅠExcellent Identification%Id＞99.9及 T ＞0.75;ⅡVery good Identification%Id＞99.0及 T＞0.50;ⅢGood Identification%Id＞90.9 及 T ＞0.25;ⅣAcceptable Identification%Id＞80.0及T＞0;ⅤDoubtful profile出现如果，则其中一个测试非常违反典型生化结果。

1.3 统计学方法 应用IBM SPSS Statistics 19.0统计软件进行数据分析，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

两种方法所有鉴定的准确度均为“Good Identification”以上，甚至为“Excellent Identification”。

2.1 45株革兰阴性杆菌鉴定结果 API系列肠杆菌科接种API 20E，非发酵细菌接种非发酵API 20NE，18～24 h完成鉴定。VITEK-Ⅱ使用GN卡，3～10 h完成鉴定。其中2011-3-A2为大肠埃希菌/粪肠球菌混合菌、2008-2-A5为大肠埃希菌(ATCC35218)、2012-2-A5为肺炎克雷伯菌(ATCC1706)、2012-1-A5为肺炎克雷伯菌(ATCC1705 KPC阳性)、2012-1-A3为阴沟肠杆菌(ATCC700323)。而沙门菌属、志贺菌属以及菌株批号为2009-1-A3的致病大肠埃希菌O111:K58需要用血清学凝集试验确认，不视为鉴定错误。脑膜炎败血伊丽莎白菌，曾称脑膜炎败血黄杆菌或脑膜炎败血金黄杆，不视为鉴定错误。对革兰阴性杆菌的鉴定结果，VITEK-32准确42株，API准确44株。

2.2 18株革兰阳性球菌的鉴定结果 API系列葡萄球菌接种API STAPE，链球菌接种 API STREP，18～24 h完成鉴定。VITEK-Ⅱ使用GP卡，3～8 h完成鉴定，其中 2012-2-A4为金黄色葡萄球菌(ATCC25923)(MSSA)、2012-1-A4为金黄色葡萄球菌(ATCC43300)(MRSA)、2011-3-A2为大肠埃希菌/粪肠球菌混合菌。有2株链球菌名称不符的细菌(2009-3-A2和2011-1-A2)，但为同一菌属，即牛链球菌复合群，API鉴定结果有一次错误，VITEK-Ⅱ无错误。

2.3 7株酵母类真菌的鉴定结果 API系列酵母菌及念珠菌接种API 20 C AUX，24～48 h完成鉴定。VITEK-Ⅱ使用YST卡，18 h完成鉴定，其中2010-3-A5为克柔假丝酵母菌(ATCC6528)。API和VITEK-Ⅱ鉴定结果均无错误。

2.4 6株其他细菌的鉴定结果 API系列厌氧菌接种API 20 A，24～48 h完成鉴定。李斯特菌接种API Listeria、棒状杆菌属接种API Coryne、芽胞菌接种API 50CHB，均为18～24 h完成鉴定。VITEK-Ⅱ使用GP卡(李斯特菌)，3～8 h完成鉴定、ANC卡(厌氧菌-棒状杆菌)6 h完成鉴定、BCL卡(需氧芽孢杆菌)14 h完成鉴定，API和 VITEK-Ⅱ鉴定结果均有一次错误。

2.5 VITEK-Ⅱ与API鉴定率的比较 API的总鉴定率大于VITEK-Ⅱ(96.0%vs 94.7%)，差异无统计学意义(χ2=4.935，P ＞0.05)。其中 API鉴定革兰阴性杆菌的鉴定率大于VITEK-Ⅱ(97.8%vs 93.3%)，而 API鉴定革兰阳性球菌的鉴定率小于VITEK-Ⅱ(94.4%vs 100%)，其余均一致(表5)。

3 讨论

1970年，法国梅里埃推出API微生物鉴定条成为细菌鉴定的国际金标准，是一种国际公认的细菌鉴定手工检索编码[4]。API是目前涵盖范围最广的细菌鉴定系列，但API毕竟是一个手工系统，因此梅里埃公司又研发了全自动微生物鉴测仪VITEK-Ⅱ。

3.1 VITEK-Ⅱ的优点 本研究结果可见，VITEK-Ⅱ在鉴定正确的数量上虽然较API少一株，但显然VITEK-Ⅱ更加简化且耗时短。因为VITEK-Ⅱ鉴定仪与传统鉴定法比较，功能多、速度快、无需附加试剂，每个试验卡有60个培养小孔，结果更准确，可鉴定超过98%的临床常见菌株，超过2000个对照表型和20000个最小抑菌浓度分布。

3.2 在质控菌鉴定中存在的问题 沙门菌与志贺菌属的菌株均需血清分型与证实。而API将一株肠炎沙门菌误检为伤寒沙门菌，但经血清分型修正错误。2011-2-A3的莫拉菌属由于是革兰阴性球杆菌，菌体小，革兰染色不易脱色，常成双或短链状排列，类似奈瑟菌，容易染成革兰阳性球菌，而VITEK-Ⅱ误用 GP鉴定卡误报产单核李斯特菌。VITEK-Ⅱ将2011-2-A2的脑膜败血伊莉莎白菌(原名脑膜炎脓毒黄杆菌)误鉴定成少动鞘氨醇单胞菌;将2008-3-A2支气管炎博德特菌(与百日咳博德特菌同属)误鉴定成木糖氧化无色杆菌，原因不明。由于API系列数据库内没有片球菌属[5]的分类资料，无法鉴定，误鉴定为乳球菌属。2011-2-A1的需氧芽孢杆菌，两种方法均误鉴定成李斯特菌，是因为该质控菌革兰染色为阳性杆菌，未见到芽孢，因此均错。对临床上较少见的致病菌，如弧菌属、棒状杆菌属、真菌等均获正确鉴定。有2株链球菌名称不符的细菌，但为同一菌属，即牛链球菌复合群，因为“牛链球菌/马肠链球菌复合群内有7个种和亚种，即马肠链球菌、解没食子酸链球菌解没食子酸亚种、解没食子酸链球菌巴氏亚种、解没食子酸链球菌马其顿亚种、婴儿链球菌婴儿亚种、婴儿链球菌结肠亚种和不解乳链球菌”[3]。

3.3 原因分析及对策 要保证在细菌室间质评中的获得好成绩，首先必须做好室内质量控制的各项工作:①待检菌株必须是纯培养。②正确观察细菌溶血情况和氧化酶、触酶、凝固酶试验，必须规范判断正确，否则会出错误结果。③革兰染色的观察必须准确无误，选择鉴定卡要慎重，必要时可通过多代培养、反复染色、加拉丝试验等，再行鉴定，否则有可能产生鉴定导向的错误。④受检菌株的菌龄应在对数生长期，冻干保存的菌株，最好能转种1～2代后，再行鉴定，准确率较高。⑤注意上机操作的全过程(包括准备细菌悬液、充填切割、上机的各个环节)最好连续进行，不能久置耽搁，以免影响结果。其他注意事项:①操作过程中的污染(混悬液、吸头、加样枪)。②试剂过期及卡片本身问题，如部分管路堵塞。造成某些生化孔未能充入菌液，造成假阴性。③读数仪光学读数头出现问题，光学系统需要经常校正。

3.4 使用API系统的问题 有时新鲜培养的纯培养细菌，鉴定结果却不好，常见原因是附加试剂过期失效。附加试剂启用后有效期仅1个月。尤其是FB试剂，颜色变深后应弃去。此外即试剂过期。对此有以下建议:①在用VITEK-Ⅱ鉴定质控菌时最好同时加上API系列，如两种方法结果不相同，需要分析原因。②有时同一份细菌标本在API与VITEK-Ⅱ鉴定结果的细菌名称不同。首先确认其英文名称是否一致。如果一致，则是一致结果。如果不一致，请复查。③有的菌株可出现“不能鉴定”，这种情况的原因需要进一步探讨，结合API和传统的双歧索引法，以做出正确判断，不能报出种名的细菌可以报该菌的属名。④对VITEK-Ⅱ数据库内无资料而不能鉴定的菌株，应同时采用其他厂家的鉴定方法，相互查缺补漏，以便顺利完成鉴定。⑤应及时更新数据库。

综上所述，要得到正确的鉴定结果，检验人员应加强微生物基础知识、手工鉴定基础和操作技能的培训，加强学习仪器原理，同时作好室内质控工作的经验也很重要的，才能迅速、准确地为临床提供可靠的诊断和治疗依据。

[1]乔宁，喻华，殷琳，等.VITEK 2 COMPACT全自动微生物分析仪性能分析[J].淮海医药，2012，30(3):211-212.

[2]张晓恒，夏云，曹何，等.VITEK-2药敏卡片检测MRSA的准确性评价[J].重庆医科大学学报，2010，9(35):1384-1386.

[3]李仲兴.牛链球菌群感染的研究进展[J].临床荟萃，2006，12(24):1802-l804.

[4]付华娥，陈天林.一株病原菌的API生化鉴定及其16S～23S rDNA 间区序列分析[J].职业与健康，2010，26(13):1478-1480.

[5]刘莉萌，张斌，东秀珠.浓香型白酒窖池中片球菌的分离与鉴定[J].酿酒科技，2007(2):22-24，28.