MKK4基因的抑癌及致癌作用

万强琨，汪庚明(综述)，江 浩(审校)

(蚌埠医学院第一附属医院肿瘤放疗科,安徽 蚌埠 233000)

目前，恶性肿瘤已成为威胁人类健康的头号杀手，其治疗失败的主要原因是浸润与转移。肿瘤转移抑制基因逐渐成为近年来的研究热点。自1988年Steeg等[1]首先从小鼠黑色素瘤中分离出nm23基因起，数十种肿瘤转移抑制基因陆续被发现，而其调节肿瘤细胞增殖、分化、死亡，抑制肿瘤细胞趋化与侵袭，限制肿瘤细胞迁徙的机制也逐渐被揭开。丝裂原活化蛋白激酶激酶4(mitogen-activated protein kinase kinase 4，MKK4)基因为新发现的肿瘤转移抑制基因，现将在国内外最新研究成果的基础上，对MKK4基因进行综述。

1 MKK4的概述

Yoshida等[2]利用微细胞染色体转移和定点克隆方法分离出的MKK4基因位于人类第17号染色体，基因全长>1200 bp，含11个外显子和1个启动子，编码1条含有399个氨基酸的蛋白质。MKK4蛋白结构由3个部分组成：位于N端的D域序列在级联反应中与c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和p38(p38 mitogen-activated protein kinase)连接；位于C端的DVD域序列与上游的各种MKKKs级联；中间部分为激酶区，包括11个亚基，其中，7、8亚基间S-I-A-K-T序列的苏氨酸与丝氨酸残基磷酸化后可激活MKK4基因[3]。MKK4 mRNA广泛地表达于人体组织，以大脑皮质、小脑、丘脑、海马体的表达最高。亚细胞定位研究显示MKK4蛋白主要表达于细胞质内，一些细胞核中也有少量表达。

2 MKK4的作用机制

首先，丝裂原激活蛋白激酶4的激酶(MKKK4)通过磷酸化丝氨酸/苏氨酸残基来激活MKK4，不同的MKKKs激活不同的MKKs，具有专一性。通过激活状态的MKK4，可激活丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路和(或)磷酸化下游信号，最终调控转录因子的活化，介导细胞的生长、分化、凋亡等生物学行为[4]。目前认为，MAPK信号通路包括：mitogen-activated protein(MAP)激酶、MAPK和有丝分裂原活化抑制剂(MEK)激酶。而目前在哺乳动物中确认的4条相互并行的MAPK通路分别是胞外信号调节激酶、JNK、p38和胞外信号调节激酶5。MKK4是一种有双重特异性的激酶，也被称为JNKK1，SEK2或MEK4，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族。MKK4可激活JNK的所有亚型(JNK1、JNK2、JNK3)和部分p38亚型(p38a、p38b)，将细胞外刺激信号转导至细胞及细胞核内，引起细胞的增殖、分化、转化及凋亡等生物学反应。多数情况下，JNK通路和p38通路表现为协同作用，凋亡信号可以同时激活这两条通路[5]。

2.1MKK4-JNK的作用机制 JNK通路在细胞接受环境应激信号后被MKK4激活。JNK活化后转移到细胞核，活化转录因子并结合到基因启动子上，提高转录活性，促进基因的表达和蛋白质的合成。对于JNK通路，目前存在一种协同作用假说，即MKK4与MKK7协同作用激活JNK通路。一些有关小鼠胚胎干细胞及成纤维细胞的实验可以论证这个假说。MKK4通过依次磷酸化酪氨酸、丝氨酸残基来激活JNK。Das等[6]发现，MKK4/MKK7磷酸化后，利用JNK通路激活核因子κB、转录因子AP-1(activator protein-1)。活化的AP-1调节下游的靶基因的表达，同时参与细胞基质的降解、新生血管形成等过程。过去的研究普遍认为，JNK通路与细胞凋亡的调节密切相关，JNK在线粒体中通过信号调控B淋巴细胞/白血病2(Bcl-2)家族成员参与细胞凋亡过程[7]。目前被认可的途径主要有两条：JNK在线粒体水平上激活内源性细胞凋亡途径的促凋亡蛋白并且诱导细胞色素C释放，最后启动级联反应引起细胞凋亡；JNK对外源性细胞周期凋亡途径起促进作用，而JNK的浓度和持久度决定了细胞在接受外源性信号刺激时是否凋亡[8]。Finegan等[9]研究发现，MKK4与Ras基因突变有关，且肿瘤形成能力的下降与MKK4通过JNK信号通路调节上皮生长因子受体的表达有关。

2.2MKK4-p38的作用机制 p38能抑制细胞周期进程，阻止细胞进入有丝分裂期[10]。在MKK4的紫外线激活实验中，不但论证了MKK4可以激活p38，同时观测到可以通过调节MKK4的水平来调节p38活化反应的强弱。MKK4通过同时磷酸化酪氨酸、苏氨酸残基激活p38，然后通过两条途径遏制细胞周期进程：直接磷酸化cdc25B分子，使细胞周期蛋白/cd2不能被激活，处于抑制状态，紫外线与烷化剂类化疗药物可介导这一途径；通过调控细胞周期基因的表达。

2.3MKK4基因启动子区多态性对癌症的影响 基因的启动子决定了其转录活性，启动子的遗传变异可能影响其功能。Wei等[11]在一项直肠癌研究中同样提出，MKK4基因启动子区域内具有潜在功能的遗传变异位-1304T→G(rs3826392，相对翻译起始位点为-1304nt)的变异情况可能与患癌风险有关。TG+GG携带者患病率更低。当-1304T→G的多态位点为T等位基因时，MKK4基因启动子中存在转录因子NKx-2结合位点，而基因突变后(T转变为G)，该结合位点消失。Homminga等[12]研究指出，NKx-2结合位点具有致癌作用。另有学者推测，该位点的变异，能增加它与Tnx-2等转录因子的契合程度，增强MKK4基因的转录活性，从而使MKK4表达量增加[13]。单核苷酸多态性在基因组中具有高密度和遗传稳定性的特点，是个体间遗传差异的主要来源，也是肿瘤等多种基因疾病的发病基础。MKK4的4个主要的单核苷酸多态性位点分别为：RS3809728、RS2190853、RS9892151、RS3826392[14]。

作为MAPK信号转导通路的主要组成部分，癌基因Res信号转导通路的中心环节，MKK4基因的多态性可能对MKK4的转录启动效应产生影响并与某些癌症的发生、发展和预后有着密切的联系。

3 MKK4的抑癌作用

MKK4对肿瘤转移抑制的调控可能通过降低肿瘤细胞的黏附作用，并促进其凋亡，抑制其增殖。一些研究结果显示，MKK4基因的改变广泛存在于胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、睾丸癌、肺癌等恶性肿瘤中，与肿瘤的发生、发展有着密切的关系[15]。基因改变主要包括基因突变以及纯合子的缺失，这导致MKK4蛋白的关键亚基无法合成特定的氨基酸致使其无法对JNK磷酸化，发生概率为3%～5%。而MKK4基因显性无意义的突变能促使胚胎干细胞变异，并提高其致癌危险性。MKK4被认为是抑癌基因的另一个理由是其紧邻p53基因，仅相距10 cM(分摩)[16]。

3.1基因启动子区多态性对肺癌的抑制作用 一些研究发现，肺癌细胞株中存在MKK4基因编码区的纯合性缺失。肺癌的发生与发展是一个多因素、多阶段的过程，其中的众多因素都可以使包括MKK4在内的多种MAPKs信号通路中的分子的结构功能发生改变，由于一些研究结果显示，肺癌组织中MKK4基因表达低下，有些学者推测，MKK4基因启动子区域的改变可能对肺癌的发生有着重要影响。黄斌芳等[17]采用TaqMan探针技术检测MKK4基因启动子区多态位点rs3826392(-1304T→G)的基因型并分析其与肺癌易患性的相关性，结果发现，与携带TT基因型个体相比，携带TG杂合子的个体患肺癌的风险下降25%，而携带GG变异纯合子者患肺癌的风险下降45%，随着变异型等位基因G的个数增加，肺癌发病风险逐步降低。

3.2MKK4基因启动子区多态性对鼻咽癌的抑制作用 EB(Epstein-Barr)病毒的潜伏期蛋白是引起鼻咽癌发生的重要致癌蛋白[18]。EB病毒膜潜伏蛋白与MKK4一样，可激活JNK通路，影响细胞的正常增殖与凋亡，从而导致癌症的发生。Zheng等[19]在EB病毒-MKK4基因遗传变异的交互作用与鼻咽癌危险性研究中，采用TAQMAN技术分析MKK4基因遗传变异-1340T→G与鼻咽癌发生关联，以及EB病毒感染状态与MKK4基因遗传变异的交互作用在鼻咽癌发生中的相关性，研究表明，随着保护性等位基因G的个数增加，鼻咽癌发病风险逐步降低，EB病毒-MKK4基因交互作用，是华南人群鼻咽癌发病的危险性因素。

通过近年来关于MKK4基因 -1340T→G位点与癌症发生相关性的研究结果，认为MKK4基因启动子区多态性对多种癌症的发生、发展有着复杂而重要的作用。相关机制的研究目前未见报道。

3.3MKK4基因对卵巢癌的抑制作用 Yamada等[16]研究发现，相对于正常卵巢上皮细胞，卵巢癌细胞的MKK4基因表达显著降低。而MKK4基因呈高表达的卵巢癌其转移能力显著低于MKK4基因低表达者，且存活期延长70%。Yeamin等[20]研究同样证明类似结论。另有研究表明，MKK4基因能抑制SKOV3细胞株转移能力，使其难以形成转移细胞集落。Tanoue等[21]将未转染MKK4的人类卵巢癌细胞株SKOV3ip.1与转染MKK4的该细胞株注射于免疫缺陷的小鼠腹中，发现转染MKK4细胞株的网膜转移率较未转染者降低88%。

3.4MKK4基因对葡萄膜黑色素瘤的抑制作用 近年来的一些研究发现，不同侵袭力的葡萄膜黑色素瘤细胞间基因的表达存在较大的差异，MKK4基因的上游因子p21-activated kinase(PAK)与葡萄膜黑色素瘤细胞的侵袭性密切相关，在侵袭表型的肿瘤中，PAK1呈高表达，干扰PAK1表达后，肿瘤细胞的侵袭能力显著降低[22]。这表明，MKK4基因上游信号可通过MKK4来改变MAPK通路中JNK与p38的信号传递，从而抑制黑色素瘤的侵袭。而MKK4基因在葡萄膜黑色素瘤细胞发展过程中所起到的具体作用及机制仍在研究中。

4 MKK4基因的致癌作用

尽管近年来的多项研究证实，MKK4基因具有抑癌基因的功能，但也有研究显示，MKK4基因在人类肿瘤中的作用并非那么简单[23]。MKK4基因的上游信号Res在目前人类肿瘤中普遍呈活化状态。而MKK4基因下游信号JNK与p38以及转录因子AP-1则与多种肿瘤的发生、发展密切相关[21]。这些研究结果又在某种程度上说明了MKK4基因存在致癌作用。

4.1MKK4基因在胰腺癌细胞中的致癌作用 Cunningham等[24]在特异性靶向断裂胰腺癌细胞株PL5的MKK4基因试验中提出了MKK4基因的致癌作用。腺病毒载体可以高效地表达目的基因，这一观点在体外实验中同样适用[25]。王磊等[26]构建MKK4基因的腺病毒载体，感染不表达MKK4的胰腺癌细胞株，同时运用蛋白免疫印迹杂交技术检测常见胰腺痛细胞株中MKK4的表达，结果发现，转移胰腺腺癌细胞、原位胰腺腺癌细胞感染MKK4腺病毒后，细胞增生能力及浸润能力均显著增强。这一结果与Cunningham等[22]的实验结果不谋而合，同样论证了MKK4基因在胰腺癌中的致癌作用。

4.2MKK4基因在前列腺癌中的致癌作用 前列腺癌是西方发达国家男性发病率最高的恶性肿瘤。Khamis等[27]通过了解过渡良性前列腺上皮内瘤、局部癌和转移癌的细胞的分子基础研究工作，对公认牵连的转移抑制基因在前列腺癌的作用进行了讨论表明MKK4基因在过渡良性前列腺上皮内瘤中表达较低，而在局部晚期浸润及转移癌中出现高表达。Szmulewitz等[28]检测了人类前列腺癌和前列腺癌模型鼠的前列腺癌组织的MKK4基因和MKK7基因表达，得出类似结论，从而指出该结果可能由于相关基因转录增加和转录调控有关联。

5 小 结

MKK4基因在激活JNK、p38通路，调节、影响细胞周期及细胞凋亡中发挥着重要且极其复杂的作用。对于MKK4基因作为肿瘤抑制基因，在什么样的环境下，选择什么样的通路来抑制肿瘤的发生及转移，又在什么样的状态下发挥癌基因的作用，促进肿瘤的发生、发展，人们所知甚少。目前有学者试图建立不同的动物实验模型，进一步研究MKK4基因的抑癌、致癌机制及作用条件。这对相关肿瘤的早期诊断、治疗方案的制订、药物选择以及个体靶向治疗都有着积极的意义。

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