扇贝(Chlamys farreri)多肽通过EGFR抑制受紫外线B(UVB)诱导的HaCaT细胞凋亡*

樊 洁 王 岩 孙秀萍 韩彦弢① 王春波

(1.山东省精神卫生中心 济南 250000;2.青岛开发区卫生局卫生监督所 青岛 266555;3.青岛大学 青岛 266071)

表皮生长因子受体(EGFR)是原癌基因 c-erbB1编码的产物,表达于正常上皮细胞表面,是与配体表皮生长因子级联的信号跨膜糖蛋白(Pinkas-Kramarski,1996)。已有的研究结果表明,EGFR信号通路参与了紫外线 A(UVA)诱导的人永生化角质形成细胞株(HaCaT)细胞凋亡,并且经 8J/cm2的 UVA 辐射后EGFR基因发生突变,UVA组较正常组缺失了 TAT而插入了CTCTC碱基(闫林等,2010)。鉴于UVA与UVB的光化学与光物理学特性,UVB是否也能通过诱导EGFR引起基因突变而引起HaCaT细胞凋亡？其突变位点与UVA诱导的基因突变位点是否具有差异等问题值得探讨。

扇贝多肽(Polypeptide fromChlamys farreri,PCF)是于海洋贝类栉孔扇贝中提取的水溶性小分子多肽,相对分子质量(Mr)为879,作为一种抗氧化剂能够抑制紫外线引起的皮肤角质细胞凋亡(刘晓萍等,2001)。已有的研究表明,氧自由基ROS和氮自由基RNS等氧化应激反应都能引起细胞凋亡(Thomaset al,1996;Cosentino-Gomeset al,2012)。ROS和NO可以通过激活 EGFR而导致细胞凋亡(Haertel Bet al,2012;Zhouet al,2011)。PCF能够通过EGFR阻止UVA诱导的 HaCaT细胞发生基因突变,加入 PCF孵育 2h后,虽然仍保留部分 CTCT序列,但是TAT序列得到重新修复(闫林等,2010)。扇贝多肽能否预防UVB诱导的 EGFR基因突变？能够阻止哪些位点发生基因突变？为此,本文对此进行了初步研究,以期为研究紫外辐射诱导HaCaT细胞凋亡的基因水平机制打下基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 实验材料 HaCaT由韩国延世大学惠赠;扇贝多肽由中国水产科学研究院黄海水研究所分离纯化,纯度>96%,Mr=879,用去离子水配制成 56.9mmol/L的母液,过滤除菌,4°C保存备用;EGFR抑制剂AG1478由SIGMA公司提供;Trizol由TaKaRa公司提供;SMARTer™ RACE cDNA Amplification Kit试剂盒由 Clontech公司提供;RPMI-1640培养基由Hyclone公司提供;Hoechst33258染色试剂盒,由碧云天公司提供。

1.1.2 实验仪器 HF90/HF240 CO2培养箱由Heal Force公司提供;IX50倒置显微镜由Olympus公司提供;DMI4000B荧光显微镜由Leica公司提供;K5500超微量分光光度计由北京凯奥提供;UVB灯管由北京师范大学光电仪器厂提供。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养、实验分组和UVB诱导HaCaT细胞凋亡模型 HaCaT细胞由RPMT-1640培养基(10%胎牛血清,1×105U/L青霉素和100mg/L硫酸链霉素),37°C,5%CO2常规培养。实验前将细胞接种于六孔板中,接种密度为 2.5×105,随机分为 6组:对照组;UVB 模型组;UVB+1μmol/LAG1478组;UVB+1.42mmol/L PCF(PCF1)组;UVB+2.84mmol/L PCF(PCF2)组;UVB+5.69mmol/L PCF(PCF3)组。

待细胞生长至每孔融合 80%—90%时,加药,放入37°C、含5%CO2的细胞培养箱中孵育2h后,吸去培养基,加入2ml Phosphate Buffer Solution(PBS)缓冲液,对照组用锡箔纸盖住,其余组细胞暴露于UVB灯管下,辐射强度为20mJ/(cm)2。紫外线照射后,将在各孔中重新加入培养液继续常规培养。

1.2.2 Hoechst 33258 荧光染色检测细胞凋亡 取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡10min,用PBS缓冲液洗涤三遍,再用 RPMT-1640培养液洗涤一遍。将盖玻片置于六孔板内,种入 HaCaT细胞培养过夜,使细胞融合约为 80%满。UVB照射刺激细胞发生凋亡,18h后吸尽培养液,加入 0.5ml固定液,固定10min。去固定液,用PBS缓冲液洗两遍,每次3min,手动晃动数次,吸尽液体。加入0.5ml Hoechst33258染色液,染色5min,手动晃动数次,用PBS缓冲液洗两遍,每次3min。滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上,盖上贴有细胞的盖玻片。荧光显微镜检测,激发波长在350nm左右,发射波长在460nm左右。坏死细胞不被 Hoechst染色,出现细胞凋亡时,细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状蓝色荧光及明显核形态变化。每孔细胞随机选择6个观察视野,每次至少计数500个细胞,按公式(1)计算细胞凋亡率(R)。

其中，n表示凋亡细胞数，N表示细胞总数

1.2.3 总RNA的提取及cDNA第一链的合成 提取对照组,UVB模型组和UVB+5.69 mmol/LPCF组三组样品的总RNA,将1ml Trizol溶液中溶解的细胞加入 200μl氯仿,振荡混匀后 4°C下 12000r/min离心15min。抽提上清液,异丙醇沉淀,4°C 12000r/min离心10min,75%乙醇沉淀,4°C下12000r/min离心5min,去上清干燥后加 10μL无核酸酶的超纯水溶解。用K5500超微量分光光度计测量 RNA浓度,并调整质量浓度为1g/L。1%的琼脂糖凝胶电泳测RNA的质量。使用逆转录酶SMARTScribe™ Reverse Transcriptase和引物 3′-RACE CDS Primer A(5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGACTAC(T)30 V N–3′),按照 Clontech公司的SMARTer™ RACE cDNA Amplification Kit试剂盒步骤,分别对3组细胞的总RNA进行逆转录合成cDNA。

1.2.4 EGFR基因的SMART-RACE扩增及生物信息学分析 根据Genebank中EGFR的cDNA核心片段序列,按照 Clontech公司的 SMARTer™ RACE cDNA Amplification Kit试剂盒步骤,设计 3′RACE 特异引物,进行巢式PCR反应扩增3′片段。使用引物3′-1(TCCACCTCGGGCACATTTTGGGAAGTT)和 UPM,分别以前面合成的三组 cDNA为模板进行第一轮PCR扩增。将第一轮PCR扩增产物稀释50倍,然后用 引 物 3′-2(GGGGATCTTGGAGTTTTTCATTGTCGC)和UPM进行第二轮PCR扩增。将第二轮PCR产物进行电泳并对目的条带进行切胶回收纯化。纯化后的PCR产物与pMD18T进行连接,转化后挑取阳性克隆测序(ABI公司)。

采用ClustalX 1.81软件进行核苷酸多序列比对。用National Center of Biotechnology Information(NCBI)的Open Reading Frame Finder(ORF Finder)功能预测DNA序列编辑的氨基酸序列。

1.2.5 统计学处理 采用SPSS17.0软件对结果进行单因素方差分析及Q检验。

2 实验结果

2.1 Hoechst 33258荧光染色检测细胞凋亡

通过Hoechst 33258荧光染色法观察各组HaCaT细胞,荧光显微镜下可观察到,正常对照组(图1A)细胞核集中、呈现均匀荧光,偶见少量自然凋亡细胞;UVB照射组(图1B)比正常组细胞凋亡细胞数量明显增多(P<0.01),EGFR抑制剂AG1478组(图1C)细胞凋亡数目比 UVB组降低(P<0.05),加入 PCF预处理后(图1D,图1E,图1F)可以抑制UVB辐射引起的细胞凋亡,并呈剂量依赖性,与 UVB组比较有显著意义(P<0.01)。量化结果如图2所示。

图1 PCF对UVB诱导的HaCaT细胞凋亡的影响(100×)Fig.1 Effect of PCF on HaCaT cell apoptosis induced by UVB(100×)

图2 Hoechst 33258 荧光染色检测细胞凋亡率Fig.2 Effect of UVB and PCF on HaCaT cell apoptosis by Hoechst33258 staining

2.2 RNA琼脂糖凝胶电泳

从总 RNA 琼脂糖凝胶电泳图(图3)中清晰可见5S,18S,28S三条明亮条带,说明所提总RNA质量较好,无降解。

2.3 PCF对 UVB诱导的 HaCaT细胞中 EGFR cDNA序列的影响

测序结果:选择正常对照组,UVB照射组,和UVB+5.69mmol/L PCF组分别进行克隆测序,图谱如图4所示,UVB照射后,UVB组(图4b)较之正常对照组(图 4a)发生碱基突变,A→G(b1),A→G(b2),T→C(b3),G→A(b4),G→A(b5),说明UVB辐射能够引起EGFR的DNA发生突变。

预先加入5.69 mmol/L PCF孵育2h后进行UVB辐射,UVB诱导的1,2,3个突变位点处并未发生碱基的改变(图4c1—图4c3),而4,5位点处碱基突变与UVB组一致,说明PCF对UVB引起的EGFR的DNA突变有一定的保护作用。

图3 RNA琼脂糖凝胶电泳图Fig.3 Agarose gel electrophoresis of RNA

图4 cDNA克隆序列测序Fig.4 The sequence of cDNA cloning

2.4 ORFfinder的翻译结果

对正常组,UVB照射组,和 UVB+5.69mmol/L PCF组的测序结果在NCBI的ORFfinder网页进行氨基酸序列翻译,如图5所示,UVB照射(图5b)后,DNA编码的氨基酸序列与正常对照组(图5a)比较发生改变,预加入PCF孵育后(图5c),氨基酸序列改变部分与正常组一致,说明PCF对UVB引起的DNA突变引起的氨基酸序列改变有一定保护作用。

3 讨论

DNA荧光染料Hoechst33258能透过完好细胞膜进入核内,凋亡细胞染色质致密,常呈月牙形斑块或碎裂,并可见凋亡小体。非凋亡细胞核染色较均匀,荧光较淡,死亡细胞不染色。本实验Hoechst33258荧光染色检测细胞凋亡结果显示,UVB辐射可诱导明显的细胞凋亡,证明了 20mJ/(cm)2UVB辐射诱导HaCaT细胞凋亡模型的成功复制,PCF能够抑制此模型细胞凋亡率,对UVB损伤的HaCaT细胞具有保护作用,加入 EGFR抑制剂 AGl478,可显著抑制UVB辐射引起的细胞凋亡,提示 EGFR分子可能参与到UVB诱导的细胞凋亡。

图5 cDNA测序后序列编码开放阅读框架Fig.5 The Open Reading Frame Finder of the cDNA sequencing

EGFR是当今国内外学者研究的与细胞凋亡机制有关的热点因子之一。EGFR是由原癌基因 c-erbB1编码的,具有1个细胞外的配体结合结构域,1个跨膜结构域,以及1个细胞内的络氨酸激酶结构域,通过与配体的结合介导信号转导。被激活的EGFR信号分子可以激活很多下游的信号通路,如丝裂原活化蛋白激酶(MAPK),信号传导及转录激活因子(STAT),磷酸酯酶 C(PLC),以及钙离子调节通道等,这些下游通路可以调节细胞增殖、转移、分化等(Avrahamet al,2011;Loet al,2006)。EGFR作为一种膜受体,可以从细胞膜传递信号到细胞核(Wanner,2007)。EGFR作为一个上游分子,在很多细胞调节过程中起着非常重要的作用,对EGFR的进一步研究对许多疾病的发生,治疗等具有十分重要的意义。紫外线照射激活EGFR所在的信号通路,EGFR表达迅速增多(Knebelet al,1996),闫林等学者证实8J/(cm)2UVA辐射可以诱导 EGFR发生基因突变,TAT序列缺失而插入了CTCTC碱基序列。本实验用 RACE法构建 EGFR cDNA进行克隆测序,结果显示经20mJ/(cm)2UVB照射后,EGFR基因序列较之正常组发生了碱基的突变A→G,A→G,T→C,G→A,G→A,与 UVA 诱导的HaCaT细胞 EGFR基因突变位点不同,这可能与UVA与UVB的波长和穿透能力有关。使用NCBI的开放阅读框架预测功能,结果显示 UVB诱导的碱基对的突变影响了氨基酸序列的编码,UVB辐射组比正常组多编码 1个开放阅读框架 1308-1470,此框架长164。

已有研究表明,UVB和UVA辐射后HaCaT细胞既能产生 ROS,也能产生 NO;PCF能够通过下调ROS和 NO的释放量来抑制细胞凋亡率(高明清等,2007;Zhanget al,2009;王春波等,2011)。ROS和RNS两者均可引起细胞凋亡(Lawleyet al,2000;Kimet al,2012),ROS和RNS都可以导致DNA氧化损伤(Helbocket al,1999;Bourretet al,2011)。近年来有新观点认为,自由基水平的升高能够激活 EGFR(Linet al,2012),EGFR信号通路的激活依赖自由基(Chenet al,2012)。自由基导致DNA损伤最常见的一种类型是OGG1编码酶来切除氧桥鸟嘌呤(Hazraet al,2007),还可以通过TDG移除胸腺嘧啶乙二醇代替以氧化胸腺嘧啶衍生物(Yoonet al,2003),及通过PAPP1促进ADP核糖共价键转移成为各种各样的核蛋白来促使BER的核酸氧化(Hainceet al,2005)。本课题组证实了UVB诱导的HaCaT细胞EGFR的基因突变是自由基水平提高引起的。

PCF是提取自扇贝废弃物中的小分子多肽,具有抗氧化作用,能抑制细胞凋亡。8J/(cm)2UVA辐射后,加入 2.84mmol/L PCF孵育 2h后,虽然仍保留部分CTCT,但是TAT序列得到重新修复。本实验中预先加入5.69mmol/L PCF孵育2h后再进行UVB辐射,虽然仍有碱基对的突变,但是部分突变未发生;氨基酸序列的翻译结果也显示PCF组没有1308-1470这段长164的开放阅读框架。碱基对的突变及PCF的抗突变作用,以及翻译后氨基酸序列,证明紫外线影响EGFR的表达在基因水平起到影响作用。PCF作为一种抗氧化剂,能够清除ROS和RNS,说明PCF保护EGFR发生基因突变可能是通过清除紫外辐射产生的自由基而抑制 EGFR的表达激活从而抑制紫外线诱导的细胞凋亡。

综上所述,UVB照射HaCaT细胞可以诱导细胞凋亡状态下 EGFR基因发生 A→G,A→G,T→C,G→A,G→A位点的基因突变,表明EGFR途径可能参与了UVB诱导的HaCaT细胞凋亡。PCF作为天然抗氧化剂可抑制UVB诱导的HaCaT细胞凋亡,其作用机制与保护EGFR部分位点不发生突变有关。本实验解释了PCF抗UVB诱导的HaCaT细胞凋亡的可能机制,为 PCF在防护紫外损伤方面的应用提供重要的理论依据。

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