气体分子信号硫化氢和缺血再灌注损伤

冯磊综述 李文志审校

综 述

气体分子信号硫化氢和缺血再灌注损伤

冯磊综述 李文志审校

缺血再灌注损伤；炎性反应；硫化氢

气体信号分子为脂溶性，内源产生的气体信号分子可以自由通过细胞膜，到达细胞的内部，直接激活细胞内的目标，减少膜结合受体的需要。气体信号分子家族包括3个主要成员：NO、CO、H2S。H2S是最后发现和描述的气体信号分子，其性质与其他2个气体超家族的成员一样，在缺血再灌注损伤中的作用逐渐阐明。调控内源性H2S的生成，应用外源性H2S在多种器官组织已经证明其有细胞保护作用。Warenycia等[1]在研究急性H2S中毒的时候首先报道了机体可以产生极低浓度的H2S。Abe 等证明H2S是一种内源性神经调节剂，生理浓度的H2S可以提高NMDA受体介导的反应，以及在海马的长时程电位起作用。另有报道一种合成H2S的酶存在于回肠、门静脉和胸部大血管，因此推测H2S可能是一种内源性的平滑肌松弛剂。

1 H2S的生理作用

在哺乳动物组织有3种催化H2S合成的酶：胱硫醚β-合成酶(CBS)、胱硫醚γ-裂解酶(CSE)和3MST。在多种组织中，主要是CBS和CSE催化生成H2S。最初认为脑组织中CBS通过激活Ca2+/钙调蛋白通路是产生H2S的主要方式，但研究发现脑组织内90%的H2S是由3MST催化生成的。L-半胱氨酸、α-酮戊二酸和半胱氨酸氨基转移酶在3MST的催化作用下生成H2S[2]。

在生理条件下，2/3的H2S解离为H+和HS-，剩下的1/3以非解离形式存在。体内产生的大多数H2S在线粒体氧化为硫酸。剩下的H2S经S-腺苷甲硫氨酸甲基化生成甲硫醇和二甲硫，或者结合正铁血红蛋白形成硫高铁血红蛋白。硫酸和硫代硫酸盐是H2S主要终产物，主要经尿液排泄。

2 内源性/外源性H2S的细胞保护作用

H2S的生理作用使其成为心脏、脑、肝、肾和肺缺血再灌注损伤的保护剂。近几年，内源性和外源性H2S的细胞保护作用在体内和体外缺血性损伤的模型中得到证实[3]。内源性H2S的作用最初应用药理学抑制剂CGL研究，而研究外源性H2S的作用是通过应用NaHS、Na2S或者吸入H2S气体[4]。

2.1 H2S与心肌缺血再灌注 一系列研究证明H2S在心肌缺血再灌注损伤中具有细胞保护作用[5，6]。Johansen研究H2S在心肌缺血再灌注损伤中的保护作用，在灌注前10min，维持至再灌注后10min持续给予NaHS(1μmol/L)，观察到梗死面积减小接近20%。Bian等[7]研究离体心脏在局部缺血情况下内源性产生的H2S和外源性应用NaHS对心脏节律的影响，发现给予NaHS治疗组由缺血再灌注引起的心律失常的持续时间和严重性会显著减轻。Bliksoen证明在心脏缺血再灌损伤中，应用H2S缺血预处理，涉及了H2S参与的蛋白激酶磷酸化，梗死面积显著减少，说明内源性H2S在心肌缺血再灌注损伤起到关键作用。内源性和外源性H2S的心脏保护作用都得到了证实。Sivarajah等[8]首先证实在心肌损伤中内源性H2S有细胞保护作用，增加内源性H2S的生成与外源性应用H2S具有相似的细胞保护作用。抑制内源性H2S的生成可以引起高血压和减少内皮依赖性血管舒张，同样小鼠的心肌缺血再灌注损伤会加重[9]。体内和体外的研究表明内源性和外源性H2S有心肌细胞保护作用，H2S对心血管疾病可能有治疗作用。

2.2 H2S与脑缺血再灌注 已有研究表明缺血再灌注损伤引起的氧化应激主要损伤神经细胞。体外研究H2S对神经细胞氧化应激的细胞保护作用，采用的谷氨酸盐和NaHS，结果表明NaHS可以防止神经细胞的谷氨酸盐毒性作用。Kimura等[10]证明H2S的神经细胞抗氧化作用不是本身的功能，而是增加了具有强抗氧化作用的谷胱甘肽的生成。然而更多的研究表明体内极低浓度的H2S具有保护作用。Florian研究大鼠在全脑缺血期间吸入H2S气体，使大鼠脑内H2S的浓度从(1.12±4.6) μg/g增加到(2.70±5.3) μg/g，可以使梗死面积减少50%。 Minamishima等[11]采用鼠科动物心脏骤停/心肺复苏的模型来研究H2S(Na2S, 0.55 mg/kg)的神经细胞保护作用。在大鼠心肺复苏前1min经股静脉给予Na2S，观察到其可以改善神经功能，减少海马区活化的凋亡蛋白Caspase-3，增加大脑皮质磷酸化的抗凋亡蛋白GSK-3β。

以上研究揭示了H2S多样的神经保护作用。体内和体外研究表明低浓度的H2S在脑内参与氧化应激反应。然而，高浓度的H2S在急性脑卒中模型中既有加重脑损伤作用，也有神经细胞保护作用。

2.3 H2S与肝脏缺血再灌注 H2S的细胞保护作用也涉及肝脏。Jha[12]证明在小鼠肝脏经历60min缺血，5 h再灌注，H2S具有肝细胞保护作用。在再灌注前5 min检测天冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)，此时这2种酶显著升高。经Na2S治疗后，AST下降71%，ALT下降69%，证明了H2S可以减轻肝脏缺血再灌注损伤。H2S的肝细胞保护作用是通过降低脂质过氧化，增加抗氧化信号，增加抗凋亡信号的表达实现的。

2.4 H2S与肾缺血再灌注 Tripatara研究内源性与外源性H2S在肾脏缺血再灌注损伤中的作用。在缺血前1h给予CSE的抑制剂 PAG，发现大鼠血浆肌酸水平升高，肾功能下降。在实行双侧肾动脉结扎的大鼠，在缺血前15 min给予NaHS，观察到肾功能显著提高，这说明H2S在肾脏缺血损伤中起到关键作用。Xu等[3]发现肾脏经历45 min缺血，6 h再灌注会影响H2S和肌酸的浓度，在大鼠肾脏缺血过程，会观察到H2S的浓度显著下降，血浆肌酸水平显著上升。证明在肾脏缺血再灌注过程中肾脏损伤来源于CBS活性降低。H2S能改善肾功能障碍相关的缺血损伤，改善肾脏供血，增高肌酐清除率，减轻氧化损伤[13]。

2.5 H2S与肺缺血再灌注 Fu等发现H2S可以作为一种肺保护药物。他们发现在大鼠肺缺血再灌注损伤中，肺缺血引起CSE的活性增加46%，引起H2S的浓度增加54%。他们在肺缺血前5 min用H2S气体(50μmol/L,100μmol/L)灌注大鼠肺组织，在肺组织形态学方面，经过H2S预处理的肺组织肺功能得到明显的改善。H2S也可以改善缺血再灌注过程中肺组织的组织学改变，改善肺的通气速率，降低肺的干湿比，改善肺组织顺应性。丙二醛常用于测定细胞内氧化水平，他们发现H2S能显著降低细胞内丙二醛的水平，说明H2S可以减轻肺的氧化应激损伤。

2.6 H2S与肠缺血再灌注 在体外培养的大鼠肠细胞分别缺氧1h、2h或3h，均复氧3h，均在缺氧(或缺血)前20min给予NaHS，发现H2S(10μmol/L)可使缺氧1h的细胞凋亡指数明显减低；缺氧3h后给予1μmol/L、10μmol/L和 100μmol/L H2S同样可使细胞凋亡指数明显降低。在大鼠体内H2S(10μmol/L或100μmol/L)可使I/R(1h/3h)的肠保持正常的颜色、绒毛形态，缺血2h再灌注3h后，只有10μmol/L H2S处理的肠没有损伤，上述研究表明H2S可明显减轻肠的I/R损伤[14，15]。

2.7 H2S与肌肉缺血再灌注 在培养的小鼠骨骼肌细胞缺氧复氧模型中，发现给予10μmol/L H2S其保护作用明显。在小鼠下肢骨骼肌I/R(3h/3h)模型中，10μmol/L H2S可明显减轻I/R所致的细胞损伤，降低凋亡指数[16]。

3 H2S的作用机制

3.1 KATP Bian等[7]对离体心肌细胞I/R(9 min/10min)研究表明，在缺血前间断3次给予NaHS(100μmol/L,每次3min)可明显减轻I/R损伤作用，细胞活力增强，细胞内钙浓度降低，给予膜KATP特异性抑制剂HMR-1098和非选择性KATP抑制剂格列苯脲均使NaHS对大鼠心肌I/R的保护作用消失，而给予线粒体KATP通道抑制剂(5-HD，100μmol/L)无上述作用，说明膜KATP在H2S减轻心肌I/R中发挥着重要作用。

以上研究表明，H2S在许多器官系统有保护作用。研究H2S在这些器官系统的作用机制很重要。在神经系统，H2S作为神经调质，通过诱导cAMP生成来调节NMDA受体，作为过氧化硝基的抑制剂。在心血管系统，已经证明H2S有许多生理作用：血管舒张剂，通过开放KATP发挥抗凋亡作用[17]，通过氧化磷酸化Akt发挥降压作用，调节白细胞介导的炎性反应，上调抗炎信号，通过保护线粒体功能发挥细胞保护作用。

3.2 H2S和凋亡 H2S的心脏保护作用的机制不只局限于调节KATP和钙超载。有许多证据表明H2S在心肌缺血再灌注中还有抗凋亡作用。激活的2个重要细胞存活通路，细胞外信号调节通路(ERK1/2)/丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI-3-kinase)，他们与PKCε相互作用或者分别抑制Bad和Caspase-9，钝化促凋亡通路。Elrod等[18]用成熟的离体肌细胞，经历6 h缺氧，12h再灌注，发现经过NaHS治疗的肌细胞会减少Caspase-3的激活，同样会减少片段样的DNA产生。这些数据表明在心肌缺血再灌注后H2S会抑制凋亡的级联。另外，Sivarajah等证明大鼠心脏局部缺血再灌注会增加心脏磷酸化的p38、MAPK、JNK1/2以及促凋亡蛋白，但是在缺血前15 min给予NaHS会显著减少磷酸化的 p38、MAPK和JNK1/2。另一种促凋亡蛋白、细胞色素C是电子传递链的基本成分，一旦受到促凋亡的刺激，会把电子从线粒体传递到细胞质。它会激活另一种凋亡蛋白，包括凋亡的活化剂Caspase-3。经过 Na2S治疗的小鼠会增加未活化的Caspase-3，减少活化的Caspase-3，减少线粒体内细胞色素C转移至细胞质。因此， Na2S在心肌缺血再灌注中保护心脏组织、防止凋亡信号的激活。

信号转导与转录激活通路(STAT)在心肌梗死中参与重要的心肌反应，高表达STAT-3亚型，表现出心脏保护作用。抑制STAT-3亚型会增加Caspase-3在心脏中的表达，因此会加重缺血再灌注损伤[19]。Calvert等[5]证明在体内H2S通过磷酸化PKCε和STAT-3，抑制了促凋亡因子Bad、上调了促存活因子Bcl-2和Bax-xL、上调热休克蛋白。因此，证明H2S在心肌缺血再灌注损伤中有抗凋亡作用。

3.3 H2S与保护线粒体 一个细胞的生存能力依靠线粒体的功能。缺血再灌注期间，线粒体经历氧剥夺、活性氧族产生过剩、线粒体膜超极化。Roth等证明高浓度的H2S在小鼠体内可以引起体温过低，通过抑制细胞色素C氧化酶，导致代谢率下降和核心温度降低。Elrod在体外模型利用Na2S治疗来评价H2S介导的线粒体保护的可能机制，他们利用离体的线粒体，缺氧30min后，用Na2S (10μmol/L)治疗后，缺氧后呼吸速率有很好的恢复。小鼠在再灌注期间给予Na2S治疗，也会减少线粒体肿胀，增加线粒体基质密度。

3.4 H2S和炎性反应 炎性反应是缺血再灌注损伤早期的主要组成。发现H2S的供体可以显著降低血浆内促炎介质白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，同时会增加抗炎介质白细胞介素-10(IL-10)，其他的研究也表明这些机制可能参与H2S的抗炎反应。缺血再灌注后，早期的炎性反应使白细胞黏附内皮细胞。Zanardo等[20]证明H2S是一种内源性调节剂，调节白细胞介素与内皮的相互作用。在白细胞黏附前30min给予Na2S (1～100μmol/kg) 或者NaHS (100μmol/kg)，观察到应用H2S治疗大鼠会减少白细胞黏附内皮细胞，并且呈剂量依赖性。许多机制研究H2S在缺血再灌注后保护组织防止炎性损伤。H2S作为一个炎性调节器的作用越来越得到认可。

4 小结

无论是内源性还是外源性的H2S，其在身体各处缺血再灌注损伤中都有保护功能。其中涉及的机制包括：通过开放 KATP通道控制细胞内Ca2+的浓度、激活抗凋亡通络(ERK1/2/MAPK、PI-3kinase/Akt, JAK-STAT)、通过保持线粒体膜电位和抑制mPTP 开放来保护线粒体功能、通过激活eNOS和 p38MAPK发挥抗炎作用。自从发现了H2S的细胞保护作用，上调内源性H2S的产生或者提供生成H2S的有效供体成为科学家和临床医师的焦点。虽然H2S在缺血再灌注损伤中有治疗作用，潜在的问题是传统的H2S供体如NaHS和Na2S，作用时间短，不能连续释放H2S[21～23]。

虽然H2S的生理作用和细胞保护作用已经得到证实，但其中涉及的机制还没有完全了解。在过去的20年中，H2S已经从一个毒性气体变成了一个有治疗缺血再灌注潜在作用的治疗药物。最近的研究揭示了在多种组织的缺血性损伤中，H2S有许多有益作用。例如，在缺血前或者缺血时，内源性或者外源性应用H2S都有心肌细胞保护作用、H2S引起的体温过低可以起到神经细胞保护作用、通过减少脂质过氧化和增加抗氧化、抗凋亡信号起到肝细胞保护作用、通过激活 CBS起到肾脏保护作用、通过激活 CSE防止肺缺血性损伤。尽管关于H2S在不同器官的生理作用的研究有许多进展，但仍有很大的研究空间。

1 Warenycia MW,Goodwin LR,Francom DM,et al.Dithiothreitol liberates non-acid sulfide from brain tissue of H2S-poisoned animals[J].Arch Toxicol,1990,64(8):650-655.

2 Shibuya N, Tanaka M, Yoshida M, et al. 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase produces hydrogen sulfide and bound sulfane sulfur in the brain[J]. Antioxid Redox Signal，2009，11(4):703-714.

3 Xu Z, Prathapasinghe G, Wu N, et al. Ischemia-reperfusion reduces cystathionine-beta-synthase-mediated hydrogen sulfide generation in the kidney[J]. Am J Physiol Renal Physiol，2009，297(1):F27-35.

4 康凯，姜洪池.气体信号分子硫化氢与疾病[J].中国普外基础与临床杂志，2009，16(2)：170-173.

5 Calvert JW, Jha S, Gundewar S, et al. Hydrogen sulfide mediates cardioprotection through nrf2signaling[J]. Circ Res，2009，105(4):365-374.

6 Osipov RM, Robich MP, Feng J, et al. Effect of hydrogen sulfide in a porcine model of myocardial ischemia-reperfusion:comparison of different administration regimens and characterization of the cellular mechanisms of protection[J]. J Cardiovasc Pharmacol，2009，54(4):287-297.

7 Bian J S，Yong Q c，Pan TT，et a1．Role of hydrogen sulfide in the cardioprotection caused by ischemic preconditioning in the rat heart and cardiac myocytes[J]．J Pharmacol Exp Ther，2006，316(2)：670-678．

8 Sivarajah A, Collino M, Yasin M, et al. Anti apoptotic and anti-inflammatory effects of hydrogen sulfide in a rat model of regional myocardial i/r[J]. Shock，2009，31(3):267-274.

9 Calvert JW, Coetzee WA, Lefer DJ. Novel insights into hydrogen sulfide mediated cytoprotection[J].Antioxid Redox Signal，2009，94(7)：805-814.

10 Kimura Y, Goto Y, Kimura H. Hydrogen sulfide increases glutathione production and suppresses oxidative stress in mitochondria[J]. Antioxid Redox Signal，2010，12(1):1-13.

11 Minamishima S, Bougaki M, Sips PY, et al.Hydrogen sulfide improves survival after cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation via a nitric oxide synthase 3-dependent mechanism in mice[J].Circulation，2009，120(10):888-896.

12 Jha S, Calvert JW, Duranski MR, et al. Hydrogen sulfide attenuates hepatic ischemia-reperfusion injury: role of antioxidant and antiapoptotic signaling[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2008，295(2):H801-806.

13 Ganster F，Burban M，de La Bourdonnaye M，et a1．Effects of hydrogen sulfide on hemodynamics，inflammatory response and oxidative stress during resuscitated hemorrhagic shock in rats[J]．Crit Care，2010，14(5)：R165.

14 Henderson PW，Weinstein AL，Sung J，et a1．Hydrogen sulfide attenuates ischemia-reperfusion injury in in vitro and in vivo models of intestine free tissue transfer[J]．Plast Re constr Surg，2011，127(1)：487-488．

15 王新宝.气体信号分子硫化氢与缺血再灌注损伤[J].首都医科大学学报，2012,33(1)：131-135.

16 Henderson P W，Singh S P，Weinstein A L，et a1．Therapeutic metabolic inhibition：hydrogen sulfide significantly mitigates skeletal muscle isehemia reperfusion injury in vitro and in vivo[J]．Plast Reconstr surg，2010，126(6)：1890-1898．

17 Yusof M, Kamada K, Kalogeris T, et al.Hydrogen sulfide triggers late-phase preconditioning in postischemic small intestine by an no- and p38mapk-dependent mechanism[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，296(3):H868-876.

18 Elrod JW, Calvert JW, Morrison J, et al. Hydrogen sulfide attenuates myocardial ischemia reperfusion injury by preservation of mitochondrial function[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2007，104:15560-15565.

19 Wang M, Wang Y, Abarbanell A, et al. Both endogenous and exogenous testosterone decrease myocardial stat3activation and socs3expression after acute ischemia and reperfusion[J]. Surgery，2009，146(2):138-144.

20 Zanardo RC, Brancaleone V, Distrutti E, et al. Hydro-gen sulfide is an endogenous modulator of leukocyte-mediated inflammation[J].FASEB J，2006，20:2118-2120.

21 Florian B, Vintilescu R, Balseanu AT, et al. Long-term hypothermia reduces infarct volume in aged rats after focal ischemia[J].Neurosci Lett，2008，438(2):180-185.

22 Tyagi N, Moshal KS, Sen U, et al. H2S protects against methionine-induced oxidative stress in brain endothelial cells[J].Antioxid Redox Signal，2009，11(1):25-33.

23 Linden DR, Levitt MD, Farrugia G, et al.Endogenous production of H2S in the gastrointestinal tract: still in search of a physiologic function[J].Antioxid Redox Signal，2010，12(9):1135-1146.

150086 哈尔滨医科大学附属第二临床医学院麻醉科

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.03.039

2013-07-18)