温度对白僵菌加拿大1号菌株侵染烟粉虱的影响

（1西南大学植物保护学院昆虫研究所，重庆400715；2开封市农林科学研究院，河南开封475004；3中国农业科学院植物保护研究所，北京100193）

温度对白僵菌加拿大1号菌株侵染烟粉虱的影响

刘 召1张先亮2雷仲仁3*

（1西南大学植物保护学院昆虫研究所，重庆400715；2开封市农林科学研究院，河南开封475004；3中国农业科学院植物保护研究所，北京100193）

为明确温度对白僵菌侵染烟粉虱的影响，在5个温度（19、22、25、28、31 ℃）条件下观察研究白僵菌加拿大1号菌株的孢子萌发率、菌丝生长速度、胞外蛋白酶及几丁质酶活性的变化情况。结果表明：28 ℃时，加拿大1号菌株的上述参数值均最大，对烟粉虱的致病力最高；温度过低或过高，孢子萌发率、菌丝生长速率、胞外蛋白酶及几丁质酶活性均显著降低，对烟粉虱的致病力也显著减弱。

温度；白僵菌；加拿大1号；烟粉虱

烟粉虱〔Bemisia tabaci（Gennadius）〕属同翅目粉虱科，是花卉和温室蔬菜的重要害虫，在我国多省份均有分布，且危害日益严重。在生产实践中，其虫口密度的控制在很大程度上依赖化学杀虫剂。但由于烟粉虱世代周期短，繁殖力强，且若虫体表密布蜡质，对有机磷、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯等常规杀虫剂均产生了高水平抗性，对昆虫生长调节剂和烟碱类杀虫剂也产生了抗性（何玉仙和黄建，2005）。因此，发展包括利用白僵菌等生物防治手段在内的多种防控策略，实现烟粉虱种群的有效控制已经成为目前农业生产中一个亟需解决的问题。

已有的研究表明，包括白僵菌在内的多种虫生真菌是控制烟粉虱的重要生物防治手段之一（Wraight et al.，1998；Poprawski et al.，2000；Faria & Wraight，2001；Charnley，2003），但由于受环境条件影响大，杀虫效果不稳定，在实际生产中的应用及推广存在着很大限制。本研究从环境因子中的温度着手，明确温度对白僵菌加拿大1号菌株毒力的影响，为其在温室等保护地的烟粉虱治理应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫源及菌株

烟粉虱采自中国农业科学院植物保护研究所温室，在（25±1）℃、L∶D＝14 h∶10 h条件下用四叶一心的甘蓝苗饲养。白僵菌加拿大1号（加1）菌株为加拿大同行友情赠送，在实验室内用萨氏培养基培养，前7 d完全黑暗、25 ℃培养，后7 d完全光照、22 ℃培养，获得的分生孢子粉用0.1%吐温-80溶液配制成1×108个·mL-1的孢子悬浮液。

1.2 温度对加拿大1号菌株毒力影响的测定

选取带有30头左右的2龄烟粉虱若虫的甘蓝叶片，放入1×108个·mL-1的孢子悬浮液中浸泡30 s；以0.1%吐温-80溶液处理为对照。室温下风干，放入盛有琼脂∶蒸馏水＝1.5 m∶100 V的培养皿中，用封口膜封口保湿，随后分别放入19、22、25、28、31 ℃的光照培养箱中，每处理重复6次。随后8 d中，每12 h观察1次若虫存活及感染情况，并将感染若虫保湿处理，待长出菌丝后镜检以确定其是否为白僵菌侵染。

1.3 温度对加拿大1号菌株菌落生长及孢子萌发影响的测定

将直径为9 cm的培养皿灭菌后，倒入15 mL的萨氏培养基冷却，取50 μL 1×108个·mL-1的加1孢子悬浮液点于培养基中央，分别置于19、22、25、28、31 ℃的光照培养箱中，光照周期设定为L∶D＝14 h∶10 h。每天定时测定菌落直径以此判定菌丝生长速率，并记录初始产孢时间。以0.1%吐温-80溶液处理为对照，每处理重复6次。

取灭菌后的盖玻片，四周涂上凡士林，中央滴上30 μL营养液（水1 L、葡萄糖1 g、蛋白胨1 g、吐温-80 1 mL），再滴上10 μL的1×108个·mL-1的孢子悬浮液。盖上盖玻片，制成萌发微环境，并将其放入盛无菌水的培养皿中保湿，分别在19、22、25、28、31 ℃条件下培养，测定孢子萌发率（张立钦 等，2000）。

1.4 温度对加拿大1号菌株表皮降解酶产量影响的测定

胞外蛋白酶产量水平测定：参照Bidochka和Khachatourians（1990）的方法，用明胶琼脂平板法测定产酶量。其中，明胶含量1%（m/V）、琼脂1.5%（m/V）。取50 μL 1×108个·mL-1的孢子悬浮液点于平板上，分别在19、22、25、28、31 ℃条件下培养8 d后，用15%（m/V）HgCl2溶液（溶于2 moL·L-1的HCl中）处理平板，菌落周围即可显示透明环，以透明环直径与菌落直径的比值表示蛋白酶的产量。以0.1%吐温-80溶液处理为对照，每处理每次测6个菌落，结果用平均数±标准差表示。

几丁质酶产量水平测定：用平板法测定几丁质酶产量水平（张宇 等 2010），并做适当改动。培养基配方为：葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、KCl、MgSO4·7H2O各0.5%（m/V），FeSO4·2H2O、ZnSO4·7H2O各0.01%（m/V），脱壳几丁质1%（m/ V），琼脂1.5%（m/V）。取50 μL的1×108个·mL-1孢子悬浮液点于培养皿中，分别在19、22、25、28、31 ℃条件下培养8 d后测量菌落直径与透明环直径，根据透明环直径与菌落直径的比值计算几丁质酶产量。以0.1%吐温-80溶液处理为对照，每处理每次测量6个菌落，结果用平均数±标准差表示。

1.5 数据处理

采用DPS软件进行统计分析，计算毒力回归方程、半致死时间（LT50）及相关参数；采用SAS软件对孢子的萌发率、菌丝生长速率及胞外蛋白酶、几丁质酶的产量水平进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 温度对加拿大1号菌株毒力的影响

在19～31 ℃范围内，加1菌株对烟粉虱2龄若虫均能进行侵染，但烟粉虱的死亡率具有显著性差异，且LT50也不同（表1）。28 ℃为白僵菌侵染烟粉虱的最适宜温度，且此温度条件下的LT50最短；其余依次为25、31、22 ℃；最不适宜侵染温度为19 ℃，LT50最长。在19～28 ℃范围内，加1菌株对烟粉虱的侵染能力随温度升高而增强，LT50随温度升高而变短；当温度高于28 ℃时，加1菌株对烟粉虱的致病力明显下降，LT50变长。说明在一定范围内，温度升高有助于白僵菌的入侵，但过高的温度（＞28 ℃）则抑制白僵菌的入侵。

表1不同温度条件下加拿大1号菌株对烟粉虱2龄若虫的毒力测定结果

2.2 温度对加拿大1号菌株菌落生长及孢子萌发的影响

在19～28 ℃范围内，菌落生长速度随温度的升高逐渐增大；当温度高于28 ℃时，菌落生长受到抑制（表2）。28 ℃时，培养8 d的加1菌株菌落直径最大，为菌株最适生长发育的温度。当温度过高或者过低，加1菌株的生长速率均受到抑制。

表2不同温度条件下加拿大1号菌株孢子萌发及菌落生长的测定结果

温度对加1菌株孢子的萌发率也有显著影响，其中28 ℃为孢子最适宜萌发的温度（表2）。在萌发微室中培养12 h后，加1菌株孢子萌发率在19～28 ℃范围内随温度的升高而增大，28 ℃时达最大，为89.21%；当温度超过28 ℃时，孢子萌发率则降低。

温度对加1菌株初始产孢时间影响不大，除19 ℃时为5 d外其余均为6 d。

2.3 温度对加拿大1号菌株表皮降解酶产量的影响

加1菌株在不同温度条件下的胞外蛋白酶产生水平具有显著性差异（表3）。由胞外蛋白酶分解明胶所产生的透明环直径与菌落直径的比值可知，28 ℃时胞外蛋白酶产量最大；在19～28 ℃的温度范围内，胞外蛋白酶的产量随温度的升高逐渐增大，而在31 ℃时的产量又降低，说明过高的温度对胞外蛋白酶的产量有明显的抑制作用。

几丁质酶在不同温度条件下的产量同样具有显著性差异（表3），白僵菌加1菌液接种到平板上第2天开始能观测到菌斑周围出现透明圆环，说明已经开始产生几丁质酶。在19～28 ℃的温度范围内，随温度增加，酶的产量逐渐增加，但当温度高于31 ℃时产量又降低。在所测定的温度下，几丁质酶的产量呈现显著性差异，说明28 ℃条件下，几丁质酶分泌活动最旺盛，是最适合几丁质酶产生的温度。

表3不同温度条件下加拿大1号菌株胞外蛋白酶及几丁质酶的产量测定结果

3 结论与讨论

温度是影响白僵菌对烟粉虱致病力高低的重要因素（Walstad et al.，1970）。本试验首先明确了不同温度条件下白僵菌加拿大1号菌株对烟粉虱毒力的影响。在适温条件下，加1孢子的萌发率较高，对烟粉虱具有较高的致病力；当温度过高或者过低时，白僵菌孢子的萌发率显著降低，对烟粉虱的致病力也显著降低。这种现象在白僵菌侵染棉铃虫（Helicoverpa armigera）、叶螨（Tetranychus evansi）、绿盲蝽（Apolygus lucorum）的研究中也有报道（Clark et al.，1968；Doberski，1981；孙鲁娟 等，2001；Bugeme et al.，2008；Liu & Stansly，2009；仝亚娟 等，2010），说明温度通过控制白僵菌孢子的萌发率从而成为影响白僵菌侵染烟粉虱的关键因子，适宜的温度是白僵菌侵染烟粉虱的必要条件之一。

胞外蛋白酶、几丁质酶在虫生真菌入侵过程中起着打破寄主昆虫体壁防御的作用（Leger et al.，1987；Gupta et al.，1992；Leger，1995；Li et al.，2012），有研究表明胞外蛋白酶和几丁质酶的产量水平可作为判断虫生真菌的毒力高低的指标（Bidochka & Khachatourians，1990）。为进一步明确温度对白僵菌毒力的影响，本试验比较了不同温度条件下白僵菌加拿大1号菌株的胞外蛋白酶、几丁质酶产量的变化情况，发现胞外蛋白酶与几丁质酶的产量能显著影响加1菌株对烟粉虱的毒力。温度能影响白僵菌的菌落生长速度，进而影响各种酶产量的高低；同时温度能影响酶活力高低，从而影响白僵菌对寄主昆虫的致病力。综合温度对白僵菌加拿大1号菌株毒力的影响研究发现，在施用白僵菌相关制剂时，应在适宜的温度条件下（尤其是在温室及保护地等温、湿度较易调控的条件下），从而在最大程度上发挥其毒力，实现其对烟粉虱的生物防治。

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Impact of Temperature on Virulence of Beauveria bassiana Canada No.1 Isolate to Bemisia tabaci（Gennadius）

LIU Zhao1，ZHANG Xian-liang2，LEI Zhong-ren3*

（1Institute of Entomology，College of Plant Protection，Southwest University，Chongqing 400715，China；2Kaifeng Research Academy of Agriculture and Forestry，Kaifeng 475004，Henan，China；3Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China）

To identify the effects of temperature on the infection of Beauveria bassiana Cananda No.1 isolate against the tobacco whitefly， Bemisia tabaci（Gennadius），the spore germination rate，mycelial growth speed，changes in activities of extracellular proteinase and chitinase were observed and studied under 5 different temperature conditions（19，22，25，28，31℃）. The results showed that the isolate Cananda No.1 owned the maximum parameter values and the highest virulence against B. tabaci at temperature of 28 ℃. The spore germination rate，mycelial growth speed，activities of extracellular proteinase and chitinase，and virulence against B. Tabaci were significantly reduced when the temperature was higher or lower than 28 ℃.

Temperature; Beauveria bassiana; Canada No.1；Bemisia tabaci

刘召，男，讲师，主要从事害虫综合治理及化学生态学方面的研究，E-mail：liuzhao@swu.edu.cn

*通讯作者（Corresponding author）：雷仲仁，男，研究员，主要从事蔬菜害虫的综合防治利用方面的研究，E-mail：leizhr@sina.com

2013-11-22；接受日期：2014-01-26

公益性行业（农业）科研专项（201303019），国家现代农业科技城产业培育项目（Z121100001212006），国家自然科学基金项目（31201515），中国博士后科学基金项目（2013M531929），中央高校基本业务科研项目（XDJK2012C080）