双低菜籽粕酿造酱油最佳发酵工艺条件的研究

周 玥，杨秀华，郭 华

（湖南农业大学食品科技学院，湖南 长沙 410128）

菜籽粕是油菜籽提油后的主要副产品之一，分为普通菜籽粕和双低菜籽粕。菜籽粕中含有菜籽蛋白、菜籽多酚、植酸、菜籽多糖等多种成分[1]。这些成分都具有较高的利用价值。菜籽粕中含硫氨基酸如蛋氨酸、胱氨酸和组氨酸的含量较高，且含有丰富的硒和磷[2]；但蛋白质含量稍低，粗纤维含量较高，同时含有一些抗营养物质如硫甙、单宁、植酸、芥子碱等。

普通菜籽粕中硫甙含量较高（大于30 moL/g）。硫甙本身无毒，易溶于水，但在芥子酶的作用下很容易分解成异硫氰酸酯、噁唑烷硫酮及腈类等有毒物质。单宁可抑制消化酶的活性而降低蛋白质的利用率；植酸是一种很强的金属螯合剂，可降低矿物质、蛋白质、淀粉和脂质的消化利用率和单胃动物磷的利用率[3]；这些都是限制优质菜籽蛋白合理利用的主要因素[4]。由于上述原因，大部分菜籽粕/饼被直接当作肥料使用，造成了天然植物蛋白资源的极大浪费。

双低菜籽指的是油菜种子中硫代葡萄糖甙含量低，而脂肪酸组成中芥酸含量低的菜籽品种[5]。对双低油菜籽进行水酶法提油后发现，硫苷、植酸、芥子碱、丹宁等营养抑制物主要存在在菜籽皮中，而脱皮是水酶法提油工艺中的一道关键工序[6-8]，故水酶法提油后的菜籽粕中几乎不含硫甙、植酸、丹宁等抗营养因子，这为双低菜籽粕作为植物蛋白在食品加工中的应用提供了一个必要的前提条件。鉴于菜籽粕含有较高的蛋白质，如能开发成食品或食品加工原料，将极大地提高菜籽饼/粕的附加值。因此，试验以双低菜籽粕为材料，通过水酶法提油，进行发酵发酵来制备酱油，并对其发酵工艺进行了优化。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试双低菜籽粕是由2011年收获的油菜籽（购自湖南省常德市）制得；供试的发酵菌种有米曲霉（Aspergillus oryzae）1~6、黑曲霉（Aspergillus niger）1~4和木霉（Trichoderma viridi）（湖南农业大学食品科技学院微生物实验室）。

试验主要试剂：氢氧化钾、氢氧化钠、盐酸、邻苯二甲酸氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、二氯甲烷、无水乙醚、石油醚（沸程30-60℃），甲醛、三氯乙酸和酪素等，均为分析纯。

试验主要仪器：A U Y 2 2 0型分析天平（SHIMADZU公司），722s型分光光度计（上海棱光技术有限公司）， SHZ- 82A型水浴恒温振荡器（上海比朗仪器有限公司），TP-3000E电子天平（上海穗康仪器有限公司），pHS-3E pH计（上海雷磁仪器厂），101A-SET电热鼓风干燥箱（上海实验仪器厂有限公司），2XJ-IIB低速大容量多管离心器（上海本昂科学仪器有限公司），旋风分离机（东莞市重源塑料机械有限公司），LDZX-75KBS型立式高压灭菌锅（上海申安医疗机械厂）。

1.2 试验方法

1.2.1 菜籽粕安全性评价 经水酶法提油后，菜籽粕中可能还会有少量硫甙残留，若用此种菜籽粕制造酱油的话，有必要对其安全性进行评估，试验采用按硫脲紫外法[9]对提油后的菜籽粕进行异硫氰酸酯和嗯唑烷硫酮的测定。

1.2.2 菌种筛选 以双低菜籽粕为原料，拌入40%麸皮，分别接种米曲霉1、米曲霉2、米曲霉3、米曲霉4、米曲霉5、米曲霉6，黑曲霉1、黑曲霉2、黑曲霉3、黑曲霉4，于28℃、95%湿度下培养3d左右，至孢子成熟为止，用福林酚法[10]分别测定其蛋白酶活力，选择蛋白酶活最佳的菌种作为发酵菌种。

1.2.3 接种量 以双低菜籽粕为原料，分别接种由试验1.2.2筛选出的菌种，接种量分别为3%、5%、7%、9%，于28℃、95%湿度下培养3 d左右，至孢子成熟为止，分别测定蛋白酶的活力，以选取较佳接种量。

1.2.4 配料比 探索菜籽粕与麸皮的配料比，以最大限度利用菜籽粕为原则[11]，试验中菜籽粕与麸皮的重量比分别为5︰5、6︰4、7︰3、8︰2，9︰1，以低盐固态方法发酵后，按GB 18186-2000的标准对发酵液的主要指标进行检测。

1.2.5 单菌种发酵 以米曲霉1号与黑曲霉1号为发酵菌种，于28℃、95%湿度下培养制曲，加入15%盐水，于42℃后发酵1个月。按GB 18186-2000的标准分别对发酵液的氨态氮、酸度、色率、铵盐等指标进行检测。

1.2.6 复合菌种发酵 由于木霉（Trichoderma viride）可产生纤维素酶与果胶酶，加速细胞壁的崩解[12]， 故以米曲霉1︰黑曲霉1︰木霉比例分别为1︰1︰1、2︰2︰1、3︰2︰1、4︰2︰1、2︰3︰1，总接种量5%，菜籽粕和麸皮按7︰3的比例混合发酵，于28℃、95%湿度下培养制曲，加入15%盐水，于42℃后发酵20 d。按GB 18186-2000的标准分别对发酵液的氨态氮、酸度、色率指标进行检测。

1.2.7 发酵液的感官评定 按GB 18186-2000的感官特性要求对发酵液进行感官评定，具体评价标准见表1。

表1 高盐稀态发酵酱油感官评定标准Table 1 Sensory evaluation standards for high salt diluted state ferm entation of soy sauce

2 结果与分析

2.1 菜籽粕安全性评价

利用三波长分光光度法检测菜籽粕中硫甙含量，发现未检出硫甙；但未经提油处理的整籽、菜籽皮、菜籽仁中却能检测到硫甙。这说明在提油过程中芥子酶已被充分灭活，硫甙未被分解；或是因为在油脂提取过程中，硫甙已进入水相，残渣中的含量微乎其微，且不会分解产生有毒有害物质。

2.2 菌种筛选

以菜籽粕为培养基，按照1.2.2方法培养并测定蛋白酶活。由表2可知，米曲霉菌种中米曲霉1的蛋白酶活最高，达到14 811.26 U/g干基，说明米曲霉1最适合在菜籽粕中生长，故可选择其为酱油发酵菌种进行后续试验。黑曲霉菌种中以黑曲霉1的蛋白酶活最高，达到8 365.31 U/g干基，说明黑曲霉1也适合在菜籽粕中生长，可以作为辅助菌种。

表2 米曲霉和黑曲霉菌种的蛋白酶活力Table 2 The protease activity of Aspergillus oryzae and Aspergillus niger

2.3 最佳接种量

以菜籽粕为培养基，按1.2.3方法培养后，用福林酚法测定蛋白酶活。结果显示：当米曲霉1接种量为3%、5%、7%和9%时，蛋白酶活分别为10 727.46、12 146.03、12 216.58和12 221.73 U/g干基。因为，当接种量为5%时，其蛋白酶活已接近最大值，故在后续试验中，均以5%的接种量进行发酵。

影响米曲霉蛋白酶活的主要因素有：（1）霉菌生长情况，霉菌长势越好，产酶也会越多，物料越蓬松越有利于霉菌的生长；（2）接种量，接种量大，在同等条件下霉菌的菌落越多，产生的酶活效应也越高；（3）产孢子量，米曲酶产孢子时酶的活性最强。因此，在制曲过程中还应注意控制培养的温度及物料水分的含量。

2.4 最适配料比

由表3可知，菜籽粕与麸皮添加量为7︰3时，拌出的物料较蓬松，米曲霉在物料内外生长均匀，麸皮添加量低于30%时，拌出的物料极易成团，不利于霉菌的生长。麸皮添加量高于30%时，虽然拌出的物料很蓬松，有利于霉菌的充分生长，蛋白酶活力也相对较高，但麸皮的成本要显著高于菜籽粕，考虑到经济效益选择菜籽粕与麸皮的最是配比为7︰3。

2.5 单菌种发酵和复合菌种发酵的效果

单菌种发酵试验结果表明，米曲霉1号在菜籽粕中生长良好，蛋白酶活也比黑曲霉高，但水解蛋白的能力有限，以至于氨态氮含量达不到三级酱油的标准，这说明单菌种发酵仍存在一定的不足。

表3 配料比对米曲霉生长的影响Tab le 3 Infl uence of ingredient ratio on the grow th of Aspergillus oryzae

复合菌种发酵试验结果表明，复合菌种发酵制备的酱油均呈浅红褐色，具甜味，酱香味浓，味鲜美，但较咸，基本达到高盐稀态发酵二级酱油标准。其中以米曲霉1︰黑曲霉1︰木霉=3︰2︰1的比例复合发酵制备的酱油氨态氮含量较高，色泽较深，进行适当的调配即可达到一级或以上标准。

由表4可知，复合菌种的发酵效果明显优于单菌种发酵，原因是米曲霉主要产生中性蛋白酶、碱性蛋白酶与淀粉酶，黑曲霉主要产酸性蛋白酶、淀粉酶与果胶酶，而木霉则产生较多的纤维素酶，在适当条件下复合菌种发酵可以优势互补，充分利用发酵原料[13]。例如木霉可降解纤维素，破坏油菜籽的细胞壁，使蛋白质暴露更充分；黑曲霉除了分解蛋白质外，还可将多糖转化为寡糖与单糖，为自身与米曲霉提供更多的碳源。

表4 单菌种发酵和复合菌种发酵的效果Tab le 4 The resu lts of single strain fermentation and m ixing strains fermentation

3 结 论

试验结果表明，利用双低菜籽粕为原料酿造酱油具有一定的可行性，无安全隐患；以米曲霉1、黑曲霉1和木霉（3︰2︰1）为复合菌种，在28℃、95%湿度下培养制曲，再加入15%盐水，于42℃条件下后发酵20 d，所制备的酱油呈浅红褐色，具甜味，酱香味浓，味鲜美，基本达到GB 18186-2000规定的二级标准。

单菌种发酵试验结果表明，米曲霉1号在水酶法提油后所得菜籽粕中生长较好，酶活较高，但单菌种发酵制备的酱油，其品质无法达到GB 18186-2000的要求。其主要原因是单菌种发酵中酶系不全，产酯产香条件不够充分，导致风味较差。而复合菌种发酵弥补了这些不足，使原料中的蛋白质、淀粉、果胶与纤维素的降解率明显上升，提高了酱油中氨态氮、有机酸、醇与酯类的含量，使酱油鲜味与酱香味更浓。

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