高效液相色谱法测定烤烟非挥发性有机酸含量

尹莉丽，赵百东，杨虹琦*，柳立，陈丽娟，费明亮

（1.湖南农业大学烟草科学与健康重点实验室，湖南 长沙 410128；2.国家烟草专卖局，北京 100053）

烟草中存在多种非挥发性酸性致香成分，它们不但能改善烟气酸碱度，而且可使吃味醇和、烟气芳香。烟叶中已被鉴定出的有机酸多达200余种，其中苹果酸、草酸、柠檬酸等二元酸和三元酸占烟叶总有机酸含量的 70%左右[1–2]。这些非挥发性有机酸通过调节烟气pH值来平衡酸碱度[3–5]，在卷烟配方中添加一定量的苹果酸、乳酸等能促进唾液分泌，消除干渴口感[6]。测定和分析烤烟中非挥发性有机酸的含量，可作为不同产地、不同品种、不同栽培技术条件下生产烟叶的品质评价指标之一，对提高烤烟原料的使用效果具有重要意义。

烟叶中非挥发性有机酸含量的测定方法有气相色谱法、气谱–质谱联用法、离子色谱法、高效液相色谱法等定量分析方法[7–11]。气相色谱和气质联用法都需要先将非挥发性有机酸衍生化，转变为易挥发的酯，再进行仪器分析，样品前处理过程比较繁琐，并容易产生误差；离子色谱法虽可分离非挥发性有机酸，但由于采用强酸作为淋洗液，对仪器的某些部件有较大腐蚀作用，导致分析成本较高；高效液相色谱法分析非挥发性有机酸不需要对样品进行衍生及纯化处理，操作简便、快速、误差小，特别是对难以酯化的非挥发性有机酸有较好的测定效果。易娇[12]用超声法、李银科[13]用高速匀浆法提取并测定出烟草中的主要非挥发性有机酸，但其均为等度洗脱，在一定程度上影响了有机酸的分离及检测效果。笔者采用梯度洗脱，并对样品前处理方法进行了优化，以期为高效、简便、快速、大批量对烤烟非挥发性有机酸进行定量分析打下基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与试验仪器

草酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸（纯度≥99.5%，美国 Sigma试剂公司产品）；乳酸（纯度≥85%，国药集团化学试剂有限公司产品）；DIONEX –P680高效液相色谱仪（美国热电仪器公司出品）。

1.2 方 法

1.2.1 检测波长和流动相的选择

因非挥发性有机酸中的羰基氧和羟基氧上存在孤对电子共轭作用，因而在205 ～215 nm处有吸收峰。对草酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸和琥珀酸的标准溶液进行波长扫描，发现它们在215 nm附近都有较强的吸收，且重现性好，不受流动相的干扰，故确定215 nm为检测波长。由于KH2PO4溶液是在 215 nm波长处无吸收的弱酸电离抑制剂，用其作为流动相有利于有机酸的分离测定[11]，高浓度 KH2PO4溶液容易在泵和色谱柱中产生气泡，影响色谱系统的稳定性，而低浓度的KH2PO4影响分离效果，因此，选择0.02 mol/L KH2PO4作为流动相较为适宜。

1.2.2 色谱条件

色谱柱，Welch Ultimate，AQ–C18反相柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相，0.02 mol/L KH2PO4（pH3.0）和甲醇溶液，使用前用真空泵抽滤，并用超声波清洗器脱气；流速，0.7 mL/min；检测波长，215 nm；柱温：30 ℃；进样体积，20 μL；外标法定量；梯度洗脱[14]。

1.2.3 标准曲线制备及检出限检测

精准称取非挥发性有机酸标准品，配制成含草酸 0.4 mg/mL、苹果酸1 mg/mL、乳酸0.4 mg/mL、柠檬酸1 mg/mL、琥珀酸0.4 mg/mL的混合标准母液。将混合标准液分别稀释20、10、6、5、4倍进样分析。以检测峰面积对有机酸质量浓度作标准曲线，以3倍信噪比计算最小检测限。

1.2.4 样品前处理的优化

将初烤烟叶粉碎，过0.15 mm孔径筛。准确称取样品0.2 g，置于50 mL锥形瓶中，加入30 mL KH2PO4溶液（0.02 mol/L，pH3.0）和磷酸溶液，置于水浴锅中加热后过滤，用流动相定容至50 mL，摇匀，并用0.459 μm孔径水系纤维素膜过滤，滤液用液相色谱仪进行定量分析。

将磷酸溶液加入量设为因素A，设3 mL （A1）、5 mL（A2）、7 mL（A3）、9 mL（A4）4水平；因素B为样品酸解温度，设50 ℃（B1）、60 ℃（B2）、70 ℃（B3）、80 ℃（B4）4水平；因素C为样品酸解时间，设15 min（C1）、20 min（C2）、25 min（C3）、30 min （C4）4水平，共计16个处理。采用3因素4水平L16（45）正交试验，进行样品前处理的优化。

1.2.5 回收率和精密度检测

取同一烟叶样品6份，每份0.2 g，其中1份用作空白试验，其余每份添加质量浓度分别为 0.4、1.50、0.4、0.4、0.25 mg/mL的5种有机酸混合标样 2 mL。按照优化后方法进行非挥发性有机酸提取，过滤定容后进行HPLC 分析，并连续进样5次，计算各有机酸的回收率和相对标准偏差。

2 结果与分析

2.1 样品前处理优化对分离测定烟叶非挥发性有机酸的影响

采用极差法分析样品前处理优化正交试验结果（表1）。极差分析表明，对草酸、乳酸、柠檬酸和琥珀酸，样品酸解温度的影响大于磷酸溶液加入量和样品酸解时间；对苹果酸，样品酸解时间的影响大于样品酸解温度和磷酸溶液加入量。说明样品酸解温度和样品酸解时间对非挥发性有机酸提取量的影响较大。

从试验各因素水平的总值上看，草酸前处理以A3B3C2组合提取较好；苹果酸、乳酸前处理以A2B4C4组合提取较好；柠檬酸前处理以A2B2C3组合提取较好；琥珀酸前处理以A3B4C4组合提取较好。由于烟叶样品中草酸、苹果酸、乳酸和柠檬酸含量较高，琥珀酸含量极少，并且在试验过程中发现，高温条件下烟叶样品提取液的过滤速度要比低温条件快得多，因此，在不影响分离效果的前提下，样品前处理选择A2B4C4组合为好，即加入磷酸5 mL，酸解温度80 ℃，酸解时间30 min进行烟叶样品非挥发性有机酸提取。

表1 5种有机酸的正交试验结果Table 1 Analytical results of the orthogonal test

2.2 样品前处理对高效液相色谱法分离测定烤烟非挥发性有机酸含量的效果

2.2.1 高效液相色谱法分离测定烤烟非挥发性有机酸图谱

图1 5种非挥发性有机酸混合标准溶液及烟叶样品高效液相色谱Fig.1 The chromatomaps of the five mixture organic acids standard and the tobacco samples

采用优化前处理条件提取烟叶样品中的非挥发性有机酸，进行HPLC分析，获得了分离效果好、峰形清晰的非挥发性有机酸液相色谱图谱（图1）。由图1可知，提取液色谱图虽然存在一些杂峰，但对烟叶草酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸的分析干扰不大。

2.2.2 标准曲线检出限、精密度及回收率

5种有机酸的线性方程、相关系数、检出限及回收率见表 2。各有机酸的相对标准偏差（RSD）为 0.58%～1.99%，均小于2%；除琥珀酸外，其余有机酸的回收率均达到90%以上；最低检出限为0.03 ～0.80 μg/mL。

表2 5种有机酸的最低检出限和回收率Table 2 Detection limits and recovery efficiency for the five organic acids in tobacco

3 讨 论

由于流动相中水的比例较大，有机酸在水中容易发生电离，产生多峰现象，要使有机酸得到分离检测，应选取合适的流动相 pH，使各有机酸在流动相中均以一种形式存在。用磷酸或氢氧化钾调节流动相KH2PO4的pH值，试验中发现，pH越低，有机酸保留时间延长，当pH值为2.6或2.8时，草酸与苹果酸不能完全分离，而且低pH的流动相对色谱柱寿命有更大影响。当pH值为3.2时，草酸伴有杂质峰，且草酸和苹果酸的色谱峰变宽。当pH值调至3.0时，被测组分保留时间适当，分离度良好。此外，试验采用的Welch Ultimate色谱柱也具备了低pH的适用范围，因而流动相选择pH值3.0为好。

流动相流速影响压力的大小及各有机酸的出峰时间。流速越大，压力越大，出峰时间也越快，而压力过高，则影响色谱柱的寿命[15]。当设置柱温为30 ℃，流动相流速为0.7 mL/min时，压力保持在75×105Pa左右，系统较为稳定。

采用80 ℃水浴加温30 min，进行烟样前处理，可以降低样品提取液的黏度，使其过滤速度加快。对比试验表明，高温条件下提取烟叶有机酸的含量与常温下相同。

与气相色谱分离有机酸相比，采用液相色谱技术检测初烤烟叶样品中的非挥发性有机酸，不仅可以检测出草酸、苹果酸、柠檬酸和琥珀酸，而且还可以检测出乳酸。这是因为乳酸难以酯化，气相色谱法无法检测烟叶中乳酸的含量，高效液相色谱法则克服了这种缺陷。

[1] 刘春奎，陈勇健，黄淮焕，等．烟草中有机酸和非挥发性有机酸分析的研究进展[J]．农技服务，2010，27（10）：1329–1330．

[2] 周正红，高孔荣．烟草中化学成分对卷烟色香味品质及其研究进展[J]．烟草科技，1997（2）：22–25．

[3] 刘世亮，杜君，化党领，等．不同有机酸对烤烟品质和产值的影响[J]．作物学报，2008，34（5）：851–858．

[4] 杨虹琦，周冀衡，郭紫明，等．湖南不同烤烟中非挥发性有机酸含量的差异[J]．中国烟草学报，2006，12（4）：44–46．

[5] 韩富根．烟草化学[M]．北京：中国农业出版社，2010．

[6] 陈章玉，缪明明，孔维松，等．基质固相分散——高效液相色谱法同时测定烟草中的有机酸[J]．中国烟草学报，2007，13（1）：11–14．

[7] 肖遂，周冀衡，杨虹琦，等．气–质联用（GC/MS）法测定烟草生物碱的方法优化[J]．湖南农业大学学报：自然科学版，2010（1）：22–25．

[8] 赵景婵，郭治安，常建华，等．有机酸类化合物的反相高效液相色谱法的分离条件研究[J]．色谱，2001，19（1）：260–262．

[9] 郭亚东．云南烟草中有机酸的气相色谱研究[D]．昆明：云南大学，1988．

[10] 郭德华，夏琳．离子排斥色谱法同时测定果汁中11种有机酸[J]．色谱，2001，19（3）：276–278．

[11] 刘荣森．烟草中有机酸测定方法研究进展[J]．科技信息，2011，24：97．

[12] 易娇，尹笃林，廉世勋，等．反相HPLC法同时测定烟草中的6种有机酸[J]．烟草科技，2006（7）：36–39．

[13] 李银科，李海燕，何顺琴，等．高效液相色谱法测定烟草中有机酸[J]．理化检验：化学分册，2011（1）：62–64．

[14] 程勇，陈玲，邓晓春．Ultimate AQ C18柱HPLC法测定烟草中有机酸含量[C]// 第八届中国香料香精学术研讨会论文集．广州：中国香料香精化妆品工业协会，2010：152–156．

英文编辑：罗 维