HPLC法测定市售蒺藜饮片中3种黄酮苷元的含量

张 超

（山东中医药大学药学院，山东济南250355）

HPLC法测定市售蒺藜饮片中3种黄酮苷元的含量

张 超

（山东中医药大学药学院，山东济南250355）

目的建立高效液相色谱法同时测定蒺藜饮片中槲皮素、山柰素和异鼠李素含量的方法。方法用Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色谱柱，甲醇－0.1%甲酸溶液（47∶53）为流动相，检测波长368 nm，流速1.0 mL·min－1，柱温25℃。结果槲皮素、山柰素和异鼠李素分别在0.58～29.0、0.292～14.6、0.248～12.4μg·mL－1范围内呈良好线性关系（r＞0.999 7），平均回收率分别为100.91%、99.44%、99.20%，RSD分别为1.91%、1.85%、1.73%。结论该方法简便、快速、准确度高，可为蒺藜饮片的质量控制和炮制研究提供参考依据。

蒺藜；槲皮素；山柰素；异鼠李素；高效液相色谱法

蒺藜为蒺藜科植物蒺藜Tribulus terrestris L.的干燥成熟果实，具有平肝解郁，活血祛风，明目，止痒的功效。历版药典均有收载，《中国药典》2010年版（一部）对蒺藜药材和饮片的质量控制仅有性状、鉴别、检查项，还未有相关指标成分的含量测定项。蒺藜主要含有甾体皂苷类、黄酮类、生物碱、多糖等化合物［1］，其中，黄酮类主要是以槲皮素、山柰素、异鼠李素为苷元的黄酮苷类化合物，已有蒺藜药材水解产物黄酮苷元含量测定的相关报道［2，3］，但目前市售蒺藜饮片多为炒制，还未见相关炒蒺藜中黄酮苷元含量测定的报道。本研究建立了HPLC同时测定蒺藜饮片中槲皮素、山柰素和异鼠李素含量的方法，为控制蒺藜炮制品的质量，探讨蒺藜的炮制意义奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1100 Series型高效液相色谱仪：G1312A二元泵、G1315B紫外检测器、G1316A柱温箱（美国安捷伦科技公司）；KQ－250E型医用超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；十万分之一电子分析天平（梅特勒－托利多仪器上海有限公司）。

1.2 试药 甲醇、乙腈均为色谱纯，水为高纯水，其他试剂为分析纯。槲皮素、山柰素和异鼠李素对照品（中国药品生物制品检定所，批号分别为：100081－200406、110861－200405、110860－200406，供含量测定用）。所购5批蒺藜饮片经山东中医药大学周凤琴教授鉴定为蒺藜科植物蒺藜Tribulus terrestris L.的干燥成熟果实，分别取100 g粉碎，过三号筛，备用。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Kromasil C18（4.6 mm× 250 mm，5μm）；流动相：甲醇－0.1%甲酸溶液（47∶53）；流速：1.0 mL·min－1；柱温：25℃；检测波长368 nm；进样量20μL。槲皮素、山柰素和异鼠李素分离度良好，无其他杂质干扰，见图1。

图1 HPLC色谱图

2.2 对照品溶液制备 分别精密称取槲皮素对照品7.25 mg，山柰素对照品3.65 mg，异鼠李素对照品3.10 mg，置同一50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备 取蒺藜样品1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇－25%盐酸（4∶1）的混合溶液25 mL，密塞，称定重量，沸水浴中加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性关系考察 分别精密量取混合对照品溶液0.1、0.4、1.6、3.2 mL，置5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。再分别精密量取以上稀释溶液和原混合对照品溶液各1.0 mL，用甲醇稀释定容至5 mL。各进样20μL测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果槲皮素在0.58～29.0μg·mL－1之间呈较好的线性关系（Y＝219.55X＋2.044，r＝0.999 7），山柰素在0.292～14.6μg·mL－1之间呈较好的线性关系（Y＝262.85X－1.638，r＝0.999 8），异鼠李素在0.248～12.4μg·mL－1之间呈较好的线性关系（Y＝614.17X＋3.103，r＝0.999 7）。

2.5 精密度试验 吸取“2.4”项下一稀释混合对照品溶液（槲皮素2.32μg·mL－1，山柰素1.168μg ·mL－1，异鼠李素0.992μg·mL－1），重复测定5次，结果槲皮素、山柰素和异鼠李素的精密度均较好（RSD分别为0.76%、0.73%和0.85%）。

2.6 稳定性实验 取同一蒺藜供试品溶液，分别于0，2，4，8，12 h测定，结果槲皮素、山柰素和异鼠李素在12 h内的稳定性较好（RSD分别为1.04%、0.92%和1.21%）。

2.7 重复性试验 取5号样品粉末1.0 g，精密称定，共5份，照“2.3”项下制备供试品溶液，按确定的含量测定方法测定槲皮素、山柰素和异鼠李素的含量，结果重复性好，变异系数小，符合含量测定要求（RSD分别为1.29%、0.98%和1.35%）。

2.8 加样回收试验 取已测定含量的5号样品约0.5 g，精密称定，共5份，加入5 mL槲皮素、山柰素和异鼠李素混合对照品溶液（分别精密称取槲皮素对照品2.17 mg置10 mL量瓶，山柰素对照品1.80 mg置50 mL量瓶，异鼠李素对照品2.00 mg置50 mL量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再分别精密量取以上3种对照品溶液1.0 mL稀释定容至同一50 mL量瓶中，即得）。再精密加入甲醇－25%盐酸（4∶1）的混合溶液20 mL，按确定方法测定，结果见表1～3。

表1 槲皮素回收率试验结果

表2 山柰素回收率试验结果

表3 异鼠李素回收率试验结果

2.9 样品含量测定 分别取5批蒺藜样品1.0 g各3份，精密称定，按“2.3”项下供试品溶液制备方法及“2.1”项下色谱条件测定，并计算各样品中槲皮素、山柰素和异鼠李素含量，结果见表4。

表4 蒺藜样品测定结果（n＝3）

3 讨论

本研究所用5批蒺藜均为炒制品，是目前常用炮制品，亦是常见的市售品。样品测定结果与文献报道［2，3］均有不同程度下降，这是否与炒制相关，有待进一步确定。

安捷伦高效液相色谱仪二极管阵列检测器检测槲皮素、山柰素和异鼠李素对照品发现3者最大吸收波长分别为：槲皮素（256 nm，368 nm），山柰素（265 nm，366 nm），异鼠李素（254 nm，370 nm），因此检测波长定为368 nm。

在供试品溶液制备方法的研究中，曾比较甲醇和无水乙醇提取的差异，两者未见显著差异，还对沸水浴回流时间进行了考察，发现1 h时黄酮苷元量已达平台。流动相选择仅对甲醇－0.1%甲酸溶液洗脱比例进行了调整以实现更好的分离效果。本研究所确定蒺藜饮片水解黄酮苷元HPLC测定方法，与传统总黄酮UV测定法［4］相比，简便易行，重现性、稳定性、准确度均较好，可用于蒺藜饮片的质量控制。

［1］李瑞海.中药蒺藜活性成分及质量评价研究［D］.沈阳：辽宁中医药大学，2006：10－14.

［2］师勤，余伯阳.反相高效液相色谱法测定蒺藜类3种水解黄酮苷元的含量［J］.药物分析杂志，1999，19（2）：75－78.

［3］郝艳玲.HPLC法测定蒺藜中总黄酮的含量［J］.实用药物与临床，2006，9（5）：276－278.

［4］吴琼诗.蒺藜全草中总黄酮的含量测定［J］.广东药学院学报，1998，14（4）：273－275.

表3 3批样品含量测定结果（mg·g－1）

3 讨论

3.1 在提取条件比较时，采用本法直接加溶剂超声提取与《中国药典》2010年版（一部）［5］“三七”［含量测定］项先溶剂浸泡过夜再加热回流提取两法比较，两法提取效果没有显著差异，而本文采用的方法更简便、快捷。

3.2 本文建立的方法具有操作简便、灵敏度高、重复性好、测定准确等优点，能同时测定三七的3种主要活性成分，可以作为疏血通脉胶囊重要的质量控制指标之一。

参考文献：

［1］刘泰，韦必清，韦玉进.醒脑通脉胶囊对脑缺血再灌注损伤神经细胞凋亡的影响［J］.辽宁中医杂志，2005，32（2）：89－91.

［2］刘泰，秦若飞，张青萍，等.醒脑通脉胶囊对大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑后织IL－1β、IL－6和IL－8含量的影响［J］.广西医科大学学报，2008，25（1）：1－4.

［3］刘泰，谭璐璐，秦若飞，等.醒脑通脉胶囊对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠TNF－a的影响［J］.广西中医学院学报，2008，10（4）：13－16.

［4］姚曦，何伟，李勇，等.HPLC法测定复方贞术调脂胶囊中三七皂苷R1和人参皂苷Rg1、Rb1的含量［J］.中国药房，2011，22（15）：1398－1400.

［5］国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版（一部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：11.

Determ ination of three flavonoid aglycones in Fructus tribuli by HPLC

ZHANG Chao
（Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China）

ObjectiveTo establish a HPLCmethod for the determination of the content of quercetin，kaempferol and isorhamnetin in Fructus tribuli.MethodsKromasil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）column was used to analyze three flavonoid aglycones contentwith methanol－0.1%methanoic acid aqueous solution（47∶53）as mobile phases.The flow rate was 1.0 mL·min－1.The detection wavelength was set at368 nm.ResultsThe linearity of each standard was established in the concentration range of0.58～29.0μg·mL－1for quercetin，0.292～14.6μg·mL－1for kaempferol，0.248～12.4 μg·mL－1for isorhamnetin，with correlation coefficient r＞0.999 7.The average recoveries（n＝5）of three flavonoid aglyconeswas 100.91%，99.46%，99.20%with the RSD of 1.91%，1.85%，1.73%，respectively.ConclusionThemethod was rapid，simple and accurate，which can be used in the quality control in Fructus tribuli.

Fructus tribuli；quercetin；kaempferol；isorhamnetin；HPLC

R927.2

：A

2095－5375（2014）03－0139－003

中医药行业科研专项项目－20种中药饮片炮制技术规范研究（No.201207004－9）

张超，男，博士研究生，副教授，研究方向：中药新药研究，E－mail：zhangchaotcm＠126.com