UPLC法测定氨苄西林有关物质

魏长峰，李平原，宋玉平，姜小平

（齐鲁制药有限公司，山东济南250100）

UPLC法测定氨苄西林有关物质

魏长峰，李平原，宋玉平，姜小平

（齐鲁制药有限公司，山东济南250100）

目的建立超高效液相色谱检测氨苄西林有关物质的方法。方法采用Acquity UPLC HSSC18色谱柱，以含有冰醋酸、磷酸二氢钾水溶液和乙腈的不同比例的混合液为流动相进行梯度洗脱，流速为0.5 mL·min－1，检测波长为254 nm，柱温为35℃，进样量为5μL。结果氨苄西林在0.272 1～32.652μg·mL－1范围内r≥0.999 9；该方法专属性，重复性，耐用性，溶液稳定性良好。各组分间相互无干扰，与HPLC具有同等的检测能力。结论该方法专属性强，灵敏度高，效率较高，可作为氨苄西林有关物质的检测有效方法。

氨苄西林；超高效液相色谱；有关物质

氨苄西林为药典［1］收载的广谱半合成青霉素，应用范围较广，有关物质检测方法为HPLC法，收录于《中国药典》2010年版，其检测方法存在平衡时间较长，检测效率偏低的缺点。超高效液相色谱法［2，3］（UPLC）为近几年推出并逐渐推广使用的一种方法，较常规的液相色谱法（HPLC）具有高速、高分离度和高灵敏度的特点。基于UPLC的优点，本文对氨苄西林有关物质在UPLC的测试进行摸索，以提高工作效率，降低实验成本［4，5］。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 Waters Acquity UPLC色谱系统，Empower工作站，Waters 2695色谱系统。

1.2 试剂 氨苄西林对照品（EP－4.0）；头孢拉定对照品（批号：130427－200306）；供试品（市售，批号：10817055、10817056、10817057）；乙腈（分析纯，Merck公司，批号：I599130130）；磷酸二氢钾（分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号：F20110913）；冰醋酸（分析纯，天津富宇精细化工有限公司，批号：101127）；蒸馏水（自制）。

2 实验方法

2.1 超高效液相色谱条件 超高效液相色谱仪：Waters Acquity UPLC；检测器：TUV检测器；波长：254 nm；柱温：35℃；色谱柱：Waters HSS T3 C18柱（2.1 mm×50 mm，1.8μm）；流速：0.5 mL·min－1；流动相A：取0.5 mL冰醋酸、50 mL 0.2 mol·L－1磷酸二氢钾和50 mL乙腈混合后，用水稀释至1 000 mL；流动相B：取0.5mL冰醋酸、50mL 0.2mol·L－1磷酸二氢钾和400 mL乙腈混合后，用水稀释至1 000 mL，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序表

2.2 高效液相色谱条件 参照《中国药典》2010年版（二部）［1］。

2.3 溶液的制备 有关物质分辨液：取头孢拉定对照品约2.0 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取此溶液5 mL和5mL有关物度对照品溶液混合，作为分辨液。

有关物质对照品溶液：取无水氨苄西林对照品约27.0 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取5 mL，置100 mL容量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，作为有关物质对照品溶液。

有关物质供试品溶液（临用现配）：取氨苄西林供试品约31.0 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀。

3 实验结果

3.1 系统适用性试验结果 分别采用UPLC和HPLC对氨苄西林系统适用性溶液进行进样检测，氨苄西林峰与头孢拉定峰均能很好的分离，分离度均大于3.0，结果见图1。

图1 氨苄西林系统适用性溶液UPLC图谱与HPLC图谱

3.2 系统精密度试验结果 取有关物质对照品溶液，按上述色谱条件试验，重复进样6次，氨苄西林保留时间和峰面积的RSD分别为0.4和0.1%。

3.3 专属性试验结果 取一定量的氨苄西林分别进行酸、碱、氧化、高温、光照破坏实验，同时取氨苄西林各起始物料、氨苄西林粗品按照上述色谱条件进行实验，结果表明各起始物料峰与氨苄西林峰均能有效分离，破坏降解后各杂质峰均能与主峰有效分离，不会干扰样品的检测。

3.4 检测限 取稀释剂作为空白溶液按上述条件进行检测，计算仪器的基线平均噪声。

称取无水氨苄西林对照品27.21 mg，置50 mL容量瓶中，加流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀。用流动相A逐步稀释至氨苄西林峰的峰高为基线噪声的3倍作为检测限溶液，计算出氨苄西林的检测限为0.068μg·mL－1。

3.5 定量限 根据检测限项下的计算的结果对氨苄西林对照品溶液进行定量稀释，按上述色谱条件进行检测，记录色谱图，是氨苄西林峰的峰高为基线噪声的10～15倍，计算定量限为0.272 1μg·mL－1。

3.6 线性范围 在预先设定的LOQ～杂质限度的120%浓度范围内，分别配制LOQ、限度40%、限度80%、限度点、限度的120%5个浓度的溶液。按上述色谱条件进样检测，记录色谱图，以峰面积对浓度作曲线，计算回归方程与回归系数。线性回归方程为：Y＝571.983 8X－16.829 7，r＝0.999 99。

3.7 重复性 氨苄西林（批号：10817057），称取6份，按上述色谱条件分别进行实验，进行有关物质的检测。单个杂质6次的平均值为0.20%，RSD＝0%；总杂质6次的平均值为0.50%，RSD＝2.0%。

3.8 稳定性 取氨苄西林（批号：10817057）供试品一份，分别在0、1、2、4、6、8、10 h进行有关物质的检测，随着放置时间的延长，总杂质在逐渐增大，建议该样品应临用新制，在8 h内进行检测，结果见表2。

表2 供试品稳定性检测结果

3.9 耐用性 取专属性项下各溶液，配制混合溶液，针对以上色谱条件，在其他条件不变的情况下，分别将流速改变±0.1 mL·min－1，柱温改变±5℃，梯度比例改变±3%，更换同类型的其他色谱柱，对混合溶液进行实验，结果表明，改变以上比例，氨苄西林峰与相邻杂质峰均能达到有效分离。

4 样品检测

取氨苄西林样品3批，分别按照上述色谱条件和《中国药典》2010年版色谱条件进行有关物质的检测，计算杂质含量，结果如表3。

Determ ination of related substances of ampicillin by UPLC

WEIChang-feng，LIPing-yuan，SONG Yu-ping，JIANG Xiao-ping
（Qilu Pharmaceutical Co.，Ltd.，Jinan 250100，China）

ObjectiveTo develop a UPLCmethod for the determination of related substances of ampicillin.MethodsA gradientmethod using an Acquity UPLC HSSC18column and detection at 254 nm was developed，takingmixture of acetic acid and potassium dihydrogen phosphate solution and acetonitrile as mobile phase，at the flow rate of 0.5 mL· min－1.Column temperaturewas35℃，and injection volumewas5μL.ResultsThe linear ranges of ampicillin was0.272 1～32.652μg·mL－1（r≥0.999 9）.Thismethod had fine specificity，repeatability，robustness.And the solution was stable.There was no interference between the components.This method had the same detectability with HPLC method.ConclusionThismethod had good specificity，sensitivity，and efficiency.It can be used to detect related substances of ampicillin.

Ampicillin；UPLC；Related substances

R927.1

：A

2095－5375（2014）03－0148－003

魏长峰，男，研究方向：药物分析，E－mail：changfeng.wei＠qilu－pharna.com