元胡止痛系列制剂指纹图谱研究

郑露露，董远文，黄 蕾，杨 希，聂 晶

（1.湖北省食品药品监督检验研究院，湖北武汉430064；2.湖北中医药大学药学院，湖北武汉430065）

元胡止痛系列制剂指纹图谱研究

郑露露1，2，董远文2，黄 蕾2，杨 希2，聂 晶1

（1.湖北省食品药品监督检验研究院，湖北武汉430064；2.湖北中医药大学药学院，湖北武汉430065）

目的建立元胡止痛系列制剂统一的指纹图谱。方法采用Thermo Acclsim 120 C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色谱柱，乙腈－甲醇（4∶1）为流动相A，25 mmol·L－1乙酸钠溶液（含庚烷磺酸钠15 mmol·L－1，用冰醋酸调pH＝6.4）为流动相B，检测波长：280 nm；柱温：35℃，流速：1 mL·min－1进行梯度洗脱。结果指纹图谱共标定9个共有峰，利用对照品比对归属了5个峰，另采用Waters xevo G2 Q－Tof LC／MS对另外4个色谱峰进行了指认。结论 该方法分析时间短、耐用性好，可用于元胡止痛系列制剂的质量控制。

元胡止痛；指纹图谱；UPLC／DAD／Q－TOF－MS

元胡止痛系列制剂的处方由延胡索和白芷两味药组成，具有理气、活血、止痛的功效。目前具有药品批准文号的元胡止痛口服固体制剂有元胡止痛片、胶囊、软胶囊、滴丸和颗粒，其中元胡止痛片、胶囊、软胶囊被《中国药典》2010年版收载［1］。延胡索的主要成分为生物碱类化合物，白芷的主要成分为香豆素类化合物［2，3］。当前对元胡止痛系列制剂的指纹图谱研究主要集中于单个剂型［4］，本实验室在前期工作中建立了元胡止痛系列制剂指纹图谱［5］，但其主要目的是阐述元胡制剂的药效物质基础，该方法分析时间长，在不同的色谱柱上相对保留值不稳定。本实验在前期工作的基础上进一步优化了分析方法，比较分析了不同HPLC指纹图谱评价方法，各评价方法的结果均表明该指纹图谱分析方法稳定、适用性强，并总结了各评价方法的优缺点，为HPLC指纹图谱标准的制定提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Dionex U3000高效液相色谱仪；Waters e2695型高效液相色谱仪；Shimadzu LC－20AD高效液相色谱仪；Waters xevo G2 Q－Tof液质联用仪；Waters 2489UV／Visible Detector；色谱柱：①Thermo Acclsim 120 C18；②Dionex Acclaim 120 C18；③Waters Symmetry C18。甲醇、乙腈为色谱纯；水为重蒸水；其余试剂均为分析纯。

1.2 试药 对照品盐酸巴马汀（批号：110732－200005）、延胡索乙素（批号：110726－200610）、欧前胡素（批号：110826－201013），对照药材延胡索（批号：120928－201007）、白芷（批号：120945－200707）均购于中国药品生物制品检定所；对照品海罂粟碱（批号：00007241－807）购于ChromaDe；对照品去氢延胡索甲素（批号：042－30751）购于和光纯药工业株式会社。

元胡止痛片剂、胶囊剂均为多家生产，片剂共收集了3家企业的3批样品，胶囊剂共收集了3家企业的3批样品；元胡止痛滴丸／颗粒／软胶囊均为独家生产品种，共收集了滴丸／颗粒／软胶囊各3批样品。各剂型的样品收集情况见表1。

表1 各剂型样品收集情况一览表

2 方法

2.1 色谱条件 采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，乙腈－甲醇（4∶1）为流动相A，25 mmol·L－1乙酸钠溶液（含庚烷磺酸钠15 mmol·L－1，用冰醋酸调pH＝6.4）为流动相B，检测波长：280 nm；柱温：35℃，流速：1 mL·min－1，梯度洗脱程序为：0～50 min，35%～60%A；50～55 min，60%～35%A，55～60 min，35%A。

2.2 质谱条件 离子化模式为ESI＋：碰撞能低能量为4 V，梯度高能量为15～60 V，碰撞气体为高纯氩气；毛细管电压为（3 000 V／2 600 V），锥孔电压为（10 V／12 V），除溶剂温度为350℃，除溶剂气体为600 L·h－1，离子源温度为100℃，采用MSE采集方式，采集时间30 min，扫描范围100～1 200 amu，扫描时间为0.1 s。

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液的制备 取延胡索乙素对照品适量加甲醇制成每1 mL含延胡索乙素50μg对照品溶液。

2.3.2 混合对照品溶液的制备 取下述对照品，加甲醇制成分别含：盐酸巴马汀20μg、去氧延胡索甲素20μg、海罂粟碱20μg、延胡索乙素50μg、欧前胡素20μg的混合对照品溶液。

2.3.3 对照药材溶液的制备 分别取延胡索对照药材1.8 g、白芷对照药材0.9 g，分别按“2.3.4”项下供试品溶液制备方法制得各单味对照药材溶液；取延胡索对照药材1.8 g、白芷对照药材0.9 g，按“2.3.4”项下供试品溶液制备方法制得混合对照药材溶液。

2.3.4 供试品溶液的制备 取各剂型装量差异项下本品内容物，研细，取约一次服用量，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入浓氨试液－乙酸乙酯（1∶20）溶液50 mL，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用浓氨试液－乙酸乙酯（1∶20）溶液补足减失的重量，滤过，取续滤液25 mL，蒸干，残渣加甲醇溶解，移至5 mL量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

3 结果与讨论

3.1 色谱条件的选择和优化 延胡索中主要含有生物碱类成分，调节流动相的pH值，可使生物碱转变为阳离子BH＋形式，在含水流动相中加入离子对试剂时，BH＋与流动相中离子对试剂（烷基磺酸盐）的阴离子RSO3－结合生成不带电荷的中性离子对，增加生物碱类成分与非极性固定相间的疏水性缔合作用，使其与白芷中部分香豆素类成分保留时间集中，缩短分析时间，改善分离效果。本实验考查了离子对试剂十二烷基磺酸钠和庚烷磺酸钠对样品分离效果的影响，结果显示，当流动相中含有庚烷磺酸钠时，样品分离效果良好。

本实验考查庚烷磺酸钠浓度为5、10、15、20 mmol·L－1时对供试品中各特征峰保留值的影响，结果显示当庚烷磺酸钠浓度为15 mmol·L－1时保留时间稳定。并考察了水相pH＝3、pH＝4、pH＝5、pH＝6、pH＝6.3、pH＝6.4、pH＝6.5、pH＝6.7、pH＝7时对供试品中各特征峰保留值的影响，结果显示当流动相pH＝6.4时各特征峰分离度良好。

3.2 指纹图谱

3.2.1 指纹图谱的建立 以元胡止痛片、胶囊、软胶囊、滴丸和颗粒5种剂型共15批样品为对象，获取所有样品的色谱图，选择分离度良好，无干扰，且各个剂型中均含有的色谱峰为特征峰，最终选取了9个色谱峰作为特征峰。选择保留时间居中的7号峰为参照峰，对照指纹图谱见图1。

图1 对照指纹图谱

3.2.2 特征峰成分分析 将各成分峰与已知对照品进行比对，可归属其中5个峰；另通过液相分离制备出未知成分的特征峰峰1、2、3、9，采用UPLC／ DAD／Q－TOF－MS技术，分析MS与MS／MS数据并参考文献［6～9］对其进行了指认，结果见表2。

3.3 方法学考察

3.3.1 专属性考察 取混合对照品溶液、延胡索药材溶液、白芷药材溶液、辅料溶液及各供试品溶液，按上述色谱条件测定，色谱图见图2。结果表明各特征峰保留时间对应阴性无干扰，专属性良好。

3.3.2 进样精密度试验 取元胡止痛片供试品溶液（批号：20111103），按上述色谱条件，分别进样6次，测定。以延胡索乙素参照物相应的峰为S峰，计算各峰相对保留值，考察仪器精密度。各特征峰的相对保留时间RSD均小于0.5%，相对峰面积RSD均小于5%，结果表明仪器精密度良好。

表2 元胡止痛制剂指纹峰归属结果表

图2 HPLC色谱图

3.3.3 重复性试验 取元胡止痛片供试品溶液（批号：20111103）6份，按上述色谱条件测定，以延胡索乙素参照物相应的峰为S峰，计算各峰相对保留值，考察方法的重复性。各特征峰的相对保留时间RSD均小于0.8%，相对峰面积RSD均小于5%，结果表明方法的重复性好。

3.3.4 耐用性试验 取元胡止痛片供试品溶液（批号：20111103），按上述色谱条件，考察了不同品牌的色谱柱：①Thermo Acclsim 120 C18，4.6 mm× 250 mm；②Shimadzu VP－ODS，4.6 mm×250 mm；③Waters Symmetry C18，4.6 mm×250 mm；不同型号HPLC仪：①Dionex U3000；②Shimadzu－20AD；③Waters e2695。以延胡索乙素参照物相应的峰为S峰，计算各峰相对保留值，考察方法的耐用性。各特征峰的相对保留时间RSD均小于5%，相对峰面积RSD均小于5%，表明本方法的耐用性较好。

3.3.5 稳定性试验 元胡止痛片供试品溶液（批号：20111103），按上述色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24 h进行测定，记录色谱图。以延胡索乙素参照物相应的峰为S峰，计算各峰相对保留值，考察供试品溶液的稳定性。各特征峰的相对保留时间RSD均小于4%，相对峰面积RSD均小于5%，表明在24h内溶液稳定。

3.4 指纹图谱评价方法分析 目前HPLC指纹图谱的评价方法主要有以下几种：①选定参照峰，计算各特征峰的相对保留值。将收集的15批样品，按“2.1”项下选定的分析条件进行检测，分别记录各批样品的供试品色谱图（见图3）。将延胡索乙素（峰7）作为参照峰S，计算各峰相对保留值，结果见表3。结果表明，各峰的相对保留时间稳定，不同色谱柱、不同仪器均可重现，但相邻峰的相对保留值在±5%波动范围内互相交叉，无法通过相对保留时间准确定位；②根据多批次、多剂型样品合成对照指纹图谱（见图4），以中药指纹图谱相似度评价软件计算相似度，结果见表4。结果表明，该方法操作简单，且能从整体上反映样品优劣，但对所收集的样品批次要求较高，需全面覆盖各个生产厂家各种剂型样品，以免实验结果不准确；③采用混合对照药材图谱作为对照图谱（见图5），结果见表4。结果表明，采用混合对照药材作为随行参照，使指纹图谱的适用范围更广，操作简单，更易于不同时间、不同实验室的结果重现，但该方法对对照药材要求较高，需保证各批次对照药材间的相似度较高；④规定各特征峰与其对应药材色谱峰保留时间相同。供试品指纹图谱中应呈现9个特征峰，峰1、2、3、8、9应与白芷对照药材溶液相应色谱峰保留时间相同，峰4、5、6、7应与延胡索对照药材溶液相应色谱峰保留时间相同，结果见表5。结果表明，样品各特征峰保留时间与其相应来源药材峰保留时间一致，该方法同样采用了对照药材作为随行对照，且不同批次对照药材的相似度在一定范围内波动均可保证结果的重现性，适用性较强。

以上4种评价方法除第一种方法存在相邻峰相对保留值交叉，不利于峰定位的问题外，其余各方法均能反映元胡止痛系列制剂质量，并且各评价方法结果一致，表明该分析方法稳定性好，适用性强。

图3 15批样品的HPLC指纹图谱

表3 样品各特征峰相对保留值

图4 15批样品合成对照图谱

图5 混合对照药材图谱

表4 样品与合成对照图谱及对照药材图谱相似度计算结果

表5 样品与单味对照药材色谱峰保留时间比对结果表

续表5：

4 总结

本实验建立了稳定的元胡止痛系列制剂指纹图谱，该方法分析时间短，重现性好，适用性强，可作为元胡止痛系列制剂质量控制的手段之一，并比较分析了4种HPLC指纹图谱评价方法，各评价方法优缺点突出，可作为指纹图谱质量标准制定的参考。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版（一部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：524－526.

［2］贺凯，高建莉，赵光树.延胡索化学成分、药理作用及质量控制研究进展［J］.中草药，2007，38（12）：1909－1912.

［3］张富强，聂红，韦艺，等.白芷的化学与药理研究进展［J］.南京中医药大学学报（自然科学版），2002，18（3）：190－192.

［4］王云龙，李延雪，邵礼梅，等.元胡止痛片HPLC指纹图谱研究［J］.中草药，2011，42（3）：495－497.

［5］肖凌，侯俊杰，聂晶，等.液－质联用研究元胡止痛系列制剂特征图谱［J］.中国医院药学杂志，2012，32（8）：574－579.

［6］蔡敏，周燕，喻世涛，等.禹白芷中香豆素成分的HPLC－MS／MS分析［J］.分析测试学报，2007，26（Suppl）：164－165.

［7］卢嘉，金丽，金永生，等.中药杭白芷化学成分的研究［J］.第二军医大学学报，2007，28（3）：294－298.

［8］黄玉伟.白芷的化学成分及其药动学研究［D］.沈阳：沈阳药科大学，2007：23－25.

［9］蒋亚萍.HPLC法测定元胡止痛软胶囊中欧前胡素的含量［J］.齐鲁药事，2011，30（4）：206－208.

Study on fingerprint of Yuanhuzhitong series preparations

ZHENG Lu-lu1，2，DONG Yuan-wen2，HUANG Lei2，YANG Xi2，NIE Jing1
（1.Hubei Institute for Food and Drug Control，Wuhan 430064，China；2.College of Pharmaceutical Sciences，Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan 430065，China）

ObjectiveTo establish the unified fingerprint of Yuanhuzhitong series preparations by HPLC.MethodsThe chromatographic separation was performed on a Thermo Acclsim 120 C18（4.6 mm×250 mm，5μm）column by gradientelution with acetonitrile－methanol（4∶1）asmobile phase A and 25 mmol·L－1sodium acetate solution（contained sodium heptane sulfonate 15 mmol·L－1，adjusted pH to 6.4 with glacial acetic acid）asmobile phase B.The flow ratewas1 mL·min－1.The detection wavelength was 280 nm，and the column temperature was 35℃.Results9 common peaks on the fingerprint of Yuanhuzhitong preparations were indicated，among which 5 peaks were confirmed by contrast with reference substance，and the other 4 peaks were identified by Waters xevo G2 Q－Tof LC／MS.ConclusionThe method was less analysis time and reliable，it can be used for the quality control of Yuanhuzhitong series preparations.

Yuanhuzhitong；Fingerprint；UPLC／DAD／Q－TOF－MS

R284

：A

2095－5375（2014）03－0132－005

国家“重大新药创制”科技重大专项—中药质量标准研究和信息化体系建设平台课题中成药标准研究平台建设（No.009ZX09308－004）

郑露露，女，研究方向：药物分析方法的研究与设计，E－mail：827051036＠qq.com

聂晶，女，研究生导师，主任药师，研究方向：药物分析方法的研究与设计，Tel：027－87270482，E－mail：niejingwh＠sina.com