山楂总黄酮对酒精诱导小鼠酒精性肝病的影响

常陆林

（河南省漯河医学高等专科学校生物化学教研室，漯河462002）

山楂总黄酮对酒精诱导小鼠酒精性肝病的影响

常陆林

（河南省漯河医学高等专科学校生物化学教研室，漯河462002）

目的研究山楂总黄酮对酒精诱导小鼠酒精性肝病的影响。方法以56%体积分数白酒（1.5ml·100g-1）体重造模6周后，随机分组，山楂黄酮低、中、高剂量组（5，10，20g·kg-1）和联苯双酯组（0.6g·kg-1），在酒精继续灌胃的基础上，按剂量给药，1次·d-1，共12周。检测小鼠血清和肝组织中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、肝匀浆中肿瘤坏死因子（TNF-α）含量。结果山楂总黄酮对酒精诱导小鼠酒精性肝病形成后SOD、GSH-PX的活性含量有回升作用，并能阻止与肝病相应的ALT、AST活性及降低MDA、NO、TNF-a含量。结论山楂总黄酮对酒精诱导小鼠酒精性肝病有预防作用，可能与其抗氧化和免疫调节作用有关。

山楂总黄酮；抗氧化；酒精性肝病

山楂为蔷薇科（Rosaceae）苹果亚科落叶灌木北山楂和山里红的干燥成熟果实，中医学认为山楂具有消积化滞，补脾健胃，活血化瘀等功用［1］。而现代研究证明，山楂中含丰富山楂黄酮，具有较强的清除自由基［2］抗氧化［3］、抗炎、抗动脉粥样硬化、细胞保护作用，以及具有抗菌、消炎、抗肿瘤等多种药理作用，本文采用白酒灌胃诱导的小鼠酒精性肝损伤模型，评价山楂黄酮给药后对肝损伤组织的影响，并检测血清中ALT、AST水平及肝组织匀浆中SOD、GSH-PX活性、MDA及NO、TNF-α含量，来观察山楂黄酮的抗炎作用。

1 材料与方法

1.1试剂联苯双酯（批号：081203）购自济南金达药化有限公司；天冬氨酸氨基转移酶（ALT，批号：080907）、丙氨酸氨基转移酶（AST，批号：061203）、一氧化氮（NO，批号：081115）、超氧化物歧化酶（SOD，批号：080314）、丙二醛（MDA，批号：080812）、谷胱甘肽氧化酶（GSH-PX，批号：091203）测试试剂盒购自南京建成工程研究所；TNF-α测试试剂盒（批号：081207）购自上海西唐生物科技有限公司。

1.2实验动物昆明种小鼠，6～8周龄，雌雄兼用，18～22g；均由郑州大学实验动物中心提供（实验前于本实验室适应一周，饲养条件为：温度（22±3）℃，湿度50%～75%，光暗周期12h／12h，自由摄食、饮水。

1.3仪器旋转蒸发仪和自动纯水蒸馏器，上海亚荣生化仪器厂；超声波发生器，昆山市超声仪器有限公司；721分光光度计，上海第三分析仪器厂；550型酶标仪，Bio－RAD。

1.4受试药物的制备山楂黄酮（产品批号20110523，西安小草生物技术有限公司，总黄酮纯度≥90%）。用时以0.5%CMC-Na溶液溶解，制成混悬液，用于小鼠灌胃给药。

1.5方法

1.5.1酒精性肝损伤动物模型昆明种小鼠随机分为正常对照组，模型组，联苯双酯组（0.6g·kg-1），山楂黄酮低、中、高剂量组（5，10，20g·kg-1），每组10只，喂养适应1周后，除正常对照组以等量生理盐水灌胃外，其余各组进行造模，以56%体积分数白酒约1.5ml·100g-1体重（折合成乙醇为6.72g·kg-1体重，换算公式为：酒精重量（g）＝白酒体积（ml）×白酒酒精含量×酒精密度（0.8g· ml-1）每日清晨灌胃一次［4］。造模6周后，山楂黄酮治疗组和联苯双酯组在继续酒精灌胃的基础上，按剂量给药，1次·d-1，各组小鼠在实验期间均予以饮用水及全价营养颗粒喂养，每周称重2次，造模周期共12周。

1.5.2血清制备造模末次给药24h后（禁食12h），称重，以3%戊巴比妥麻醉，眼静脉取血并处死。冰箱静置2h以上，3000rqm离心15min，取上清分装于塑料试管中，置冰箱（-20℃）中冷冻保存。

肝组织匀浆制备。取出肝脏，先用PBS冲洗2遍，然后用双蒸馏水1∶5研磨成组织匀浆，3000rqm，10min离心后取上清液检测。

1.5.3测定方法丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、肝匀浆中肿瘤坏死因子（TNF-α）含量均按试剂盒说明进行，其中SOD、ALT、AST、NO、GSHPX及MDA用比色法测定；TNF-α用ELISA方法测定，所有比色均在96孔酶标板中由550型酶标仪完成。

1.6统计处理计量资料均以表示，应用SPSS12.0统计软件进行统计分析，多组间比较采用方差分析，相关性采用Pearson相关性分析。P＜0.05，表示有显著性差异；P＜0.01，表示有非常显著性差异。

2 结果

2.1山楂总黄酮对小鼠血清中ALT、AST水平的影响正常对照组与模型组比较，模型组ALT，AST水平明显升高（P＜0.05），通过不同剂量的山楂总黄酮的治疗，实验各组小鼠血清ALT，AST水平均有不同程度的降低（P＜0.05或P＜0.01），并呈现一定剂量-效应关系，见表1。

表1 山楂总黄酮对小鼠血清中ALT、AST水平的影响

表1 山楂总黄酮对小鼠血清中ALT、AST水平的影响

注：与模型组比较，1）P＜0.05；2）P＜0.01 vs模型组，以下表格采用相同的表示方法

组别ALT／u·L-1AST／u·L-1正常对照组37．70±11．21）123．70±11．41）模型组113．20±13．1 195．80±24．9联苯双酯组51．11±13．212）132．80±12．31）山楂总黄酮低剂量组61．30±22．112）164．90±14．71）山楂总黄酮中剂量组61．20±17．231）144．70±12．21）山楂总黄酮高剂量组52．10±11．232）135．70±3．91）

2.2山楂黄酮对各组小鼠肝组织MDA、NO的影响正常对照组与模型组相比，模型组肝组织匀浆中MDA和NO明显增加（P＜0.05；P＜0.01），说明肝脏受到一定损伤，自由基增加，通过不同剂量的山楂总黄酮的治疗组，MDA和NO均不同程度地降低（P＜0.05或P＜0.01），并呈剂量-效应关系（表2），说明山楂总黄酮具有一定的抗氧化作用。

表2 山楂黄酮对小鼠肝组织MDA、NO含量的影响

表2 山楂黄酮对小鼠肝组织MDA、NO含量的影响

ro正常对照组1．37±0．152）2．77±0．211）组别MDA／nmol·mg-1pro NO／μmol·g-1p模型组3．45±0．34 4．57±0．38联苯双酯组1．47±0．242）3．41±0．321）山楂总黄酮低剂量组3．14±0．492）4．21±0．14山楂总黄酮中剂量组1．57±0．361）3．47±0．242）山楂总黄酮高剂量组1．77±0．272）3．14±0．371）

2.3山楂总黄酮对各组小鼠肝组织GSH-PX、SOD的影响模型组GSH-PX、SOD较空白对照组明显降低（P＜0.05或P＜0.01），说明酒精对肝有一定的损伤作用，导致抗氧化物质的减少。山楂总黄酮治疗组与模型组相比，实验各组小鼠肝组织GSH-PX、SOD水平均有不同程度的升高，与阳性对照有类似的治疗效果（P＜0.05或P＜0.01），治疗效果并呈剂量-效应关系，见表3。

表3 山楂总黄酮对小鼠肝组织GSH-px、SOD含量的影响

表3 山楂总黄酮对小鼠肝组织GSH-px、SOD含量的影响

rot正常对照组73．9±3．51）172．67±21．171）组别GSH-PX／U·mg-1pro SOD／U·mg-1p模型组34．21±9．1 81．12±11．34联苯双酯组64．4±4．31）142．74±24．211）山楂总黄酮低剂量组61．4±5．42）94．21±9．432）山楂总黄酮中剂量组64．3±3．51）121．91±25．172）山楂总黄酮高剂量组65．7±2．42）152．64±25．141）

2.4山楂总黄酮对各组小鼠肝组织TNF-α的影响模型组TNF-α较正常对照组明显升高（P＜0.01），说明酒精性肝损伤与氧化应激有明显的关系，引起细胞凋亡，山楂治疗组与模型组相比，实验各组小鼠肝组织TNF-α水平均有不同程度的下降（P＜0.05或P＜0.01），各剂量山楂总组与模型组相比，均有明显治疗效果并呈剂量-效应关系，说明山楂总黄酮对肝具有一定的保护作用，见表4。

表4 山楂总黄酮黄酮对各组小鼠肝组织TNF-α的影响

表4 山楂总黄酮黄酮对各组小鼠肝组织TNF-α的影响

注：**P＜0.01vs正常对照组；1）P＜0.05；2）P＜0.01 vs模型组

ro正常对照组1．21±0．172）组别TNF-α／ug·mg-1p模型组2．74±0．26联苯双酯组1．41±0．271）山楂总黄酮低剂量组1．41±0．251）山楂总黄酮中剂量组1．54±0．152）山楂总黄酮高剂量组1．46±0．212）

3 讨论

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是由于长期大量饮酒导致的肝脏疾病，是西方国家导致肝硬化的最主要病因，也是十大常见死因之一［5］。

目前认为，酒精性肝损伤的主要原因是酒精在肝脏内代谢产生的毒性代谢产物引起的代谢紊乱和营养不良，研究报道乙醇可引起蛋氨酸代谢异常，导致燃烧脂肪的线粒体的衰败，有人提出以脂质过氧化为中心的“二次打击”假说［6］。还与组织继发性缺氧［7］、肝炎病毒感染及遗传和基因等因素有关。

本实验通过对造模小鼠通过山楂黄酮治疗，血清中ALT、AST水平较模型组有明显下降，说明山楂总黄酮能降低酒精引起急性肝损伤小鼠血清ALT和AST水平，且存在剂量效应关系。各山楂总黄酮治疗组均可不同程度地降低肝组织中MDA和NO，增加SOD、GSH-PX，并呈剂量-效应关系。说明山楂总黄酮具有一定的抗氧化作用，提示药物能通过抑制脂质过氧化反应对肝脏产生保护作用，减轻酒精对肝脏的损伤，能降低TNF-α水平，减少细胞凋亡的发生。山楂总黄酮对酒精诱导小鼠酒精性肝病有预防作用，可能与其抗氧化和免疫调节作用有关。

［1］中华人民共和国卫生部药典委员会．中国药典［S］．一部．北京：化学工业出版社，1995：22．

［2］Wang S．L．，Lee H．，Chen K．W．，et al．Cytochrome P4502E1 genetic polymorphisms and lung cancer in a Taiwanese population［J］．Lung Caneer，1999，26：27-34．

［3］Bartsch H．，Nair U．，Risch A．，et al．Genetic Polymorphism of CYPGenes，Alone or in Combination，as a Risk Modifier of Tobacco-related Cancers［J］．Cancer Epidemiology，Biomarkers＆Prevention January，2000，（9）：3-2．

［4］Fleming RE，Bacon BR．Orchestration of lron Homeostasis［J］．N Engl J Med，2005，352（17）：1741-1744．

［5］鲁晓岚，陶明，罗金燕，等．饮酒与肝病流行病学调查［J］．中华肝脏病杂志，2002，10（6）：467-468．

［6］Savas M．C．，Konlk M．，Pirim I．，et al．Serum ubiquitin levels in patients with nonalcoholic steatohepatitis［J］．Hepato-gastrocnterology，2003，50：738-741．

［7］Takei Y．，Sato N．，Kamada T．Ethanol-induced hepatic microcirculatory disturbance［J］．Nihon Arukoru Yakubutsu Igakkai Zasshi，1999，34：107-116．

Ef f e c t o f To t al Fla v o ne o f Ha w t h o r n on Et h anol In d u c e d Alc o h olic Liv e r Dis ea s e in Mic e

Chang Lulin
（Luohe M ediCal College，Luohe 462002，china）

ObjectiveTo study the effect of total flavonoids of hawthorn on ethanol induced alcoholic liver disease in mice．MethodsAnimal model was established by 56%（v／v）（1.5ml·100－1）body，which were divided hawthorn flavonoids of low，middle and high dose grouq，（5，10，20g ·kg－1）and bifendate grouq（0.6g·kg－1）after 6 weeks．Every grouq was resqectively treated for 12 weeks with total flavonoids of hawthorn，bifendate or normal saline accordingly．The activities of alanine transaminase（ALT）asqartate transaminase（AST）in serum，suqeroxide dismutase（SOD），malondialdehyde（MDA），nitric oxide（NO），glutathione qeroxidase（GSH-PX）in liver homogenate，tumor necrosis factor（TNF-α）content were investigated．Resultsotal flavone of hawthorn can increase activity of SOD，GSH-PX，diseaseing ALT，AST activity and MDA，NO，TNF-a content．ConclusionHawthorn flavonoids have a preventiveeffect on alcoholic liver disease in mice induced by alcohol，which may be related to its antioxidant and immune regulation

Hawthorn flavonoids；Antioxidant；Alcoholic liver disease

10.3969／j.issn.1672-2779.2014.07.105

：1672-2779（2014）-07-0152-02

苏 玲 本文校对：李先佳

2013-12-18）